1、动物营养学报，（）：蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡生长性能、肠道健康和盲肠微生物区系的影响饶志勇 李 玥 杨孝鹏 郭永鹏 王志祥 张 薇（河南农业大学动物科技学院，郑州）摘 要：本试验旨在探究蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡生长性能、肠道健康及盲肠微生物区系的影响。选取 日龄爱拔益加（）肉鸡 只，随机分为 组，每组 个重复，每个重复 只。对照组（组）饲喂基础饲粮，抗生素组（组）在基础饲粮基础中添加 的土霉素钙，试验组分别在基础饲粮基础中添加 的蛋白酶（组）、的蛋白酶 的丁酸梭菌（组）、的蛋白酶 的粪肠球菌（组）、的蛋白酶 的凝结芽孢杆菌（组）。试验期 。结果表明：）与 组相比，组和 组的 日龄体重和
2、 日龄、日龄平均日增重（）显著提高（）；各试验组的 日龄料重比（）显著降低（），组和 组的 日龄 显著降低（）。与 组相比，组和 组的 日龄平均日采食量（）显著提高（），组、组和 组的 日龄 显著提高（）。）与 组相比，各试验组的十二指肠、组的空肠和 组的回肠绒毛高度显著提高（），组的十二指肠和各试验组的回肠隐窝深度显著降低（），组的十二指肠和 组、组的回肠绒隐比（）显著提高（）。与 组相比，组的十二指肠隐窝深度显著降低（），显著提高（）。）与 组相比，组的空肠 显著降低（）。）与 组相比，组和 组的空肠和回肠闭合蛋白（）及空肠闭合小环蛋白（）的 相对表达量显著提高（），组的空肠 和闭锁蛋白（
3、）、组的回肠 和 的 相对表达量显著提高（）。）与 组相比，组的 和 指数显著提高（），组的 和 指数显著降低（）。与 组相比，组的盲肠厚壁菌门（）相对丰度显著提高（），组的盲肠考拉杆菌属（）相对丰度相对提高（），组的盲肠粪杆菌属（）相对丰度显著提高（）。由此可见，蛋白酶和益生菌组合添加可提高肉鸡的生长性能，改善肠道形态，维持肠道菌群平衡，促进肠道健康。在本试验条件下，基础饲粮中组合添加 的蛋白酶和 的粪肠球菌效果最佳。关键词：蛋白酶；益生菌；生长性能；肠道形态；微生物区系中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：作者简介：饶志勇（），男，河南驻马店人，硕士研究生，动物营养与饲料科学专业
4、。：通信作者：王志祥，教授，博士生导师，：；张 薇，讲师，：动 物 营 养 学 报 卷 畜牧业中抗生素滥用引发一系列畜产品安全及环境污染等问题，根据我国农业农村部第 号公告规定，自 年 月 日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料，因此，寻找新的抗生素替代品成为当下比较热门的研究方向。蛋白酶制剂作为一种绿色、安全、无污染的饲用添加剂在养殖业广泛应用，其能够提高蛋白质消化率，减少氮污染，改善肠道健康，提高畜禽的生长性能。丁酸梭菌又名铬酸菌，其能够提高肉鸡生长性能，抑制肠道炎症和维持肠道菌群的动态平衡。粪肠球菌是一种兼性厌氧菌，属于乳酸菌一类，具有调节肠道菌群、增强机体免疫功
5、能、提高生长性能的功能，在畜牧生产中具有广阔的应用前景。凝结芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，是一类乳酸菌类益生菌，具备乳酸菌抑菌和芽孢杆菌高抗逆性、抑菌等优点，在生产中能够发挥促进动物机体对营养物质的消化吸收、调节肠道微生态平衡、增强机体免疫力的作用。酶菌组合使用具有较好的应用前景，目前蛋白酶和微生态制剂配合使用的研究还鲜有报道。因此，本试验选用蛋白酶与不同微生态制剂组合，研究其对肉鸡生长性能、肠道健康和盲肠微生物区系的影响，并探讨其作用机制，以期为肉鸡生产中选取具有良好替抗效果的菌酶组合提供理论依据。材料与方法 试验动物及材料 试验动物选取 日龄爱拔益加（）肉鸡。试验所用的蛋白酶和益生菌均为河南某生
6、物科技有限公司提供，包括蛋白酶（碱性蛋白酶，活性 ）、丁酸梭菌（活菌数 ）、粪肠球菌（活菌数 ）和凝结芽孢杆菌（活菌数 ），抗生素为土霉素钙（含 土霉素）。试验设计 试验选用健康的 日龄 肉鸡 只，随机分为 组，每组 个重复，每个重复 只（公母各占），试验设计见表。试验期 。表 试验设计 组别 饲粮 基础饲粮基础饲粮 土霉素钙基础饲粮 蛋白酶基础饲粮 蛋白酶 丁酸梭菌基础饲粮 蛋白酶 粪肠球菌基础饲粮 蛋白酶 凝结芽孢杆菌 基础饲粮与饲养管理 试验所用的基础饲粮为玉米豆粕型，参照（）肉鸡营养需要标准配制，基础饲粮组成及营养水平见表。饲养试验在河南农业大学动物营养调控实验室进行，试验前对鸡舍进行
7、消毒空置处理，饲养方式为 层立体笼养，鸡群自由采食和饮水，采光为自然光照和人工补光结合，人工干预舍内温度、湿度和通风，保持适宜水平。按鸡场的制度做好防疫措施，保持鸡舍干净整洁。每天观察舍内状况，及时发现问题，记录鸡群每天的耗料量、死淘等情况。表 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）（）项目 日龄 日龄 原料 玉米 豆粕 玉米蛋白粉 磷酸氢钙 石粉 氯化钠 大豆油 期饶志勇等：蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡生长性能、肠道健康和盲肠微生物区系的影响续表 项目 日龄 日龄 赖氨酸盐酸盐 蛋氨酸 苏氨酸 预混料）合计 营养水平 ）代谢能 （）粗蛋白质 赖氨酸 蛋氨酸 苏氨酸 钙 总磷 有效磷 ）预混料为每
8、千克饲粮提供 ：日龄 ，生物素 ，叶酸 ，泛酸 ，烟酸 ，胆碱 ，；日龄 ，生物素 ，叶酸 ，泛酸 ，烟酸 ，胆碱 ，植酸酶 ，。）代谢能为计算值，其余均为实测值。，指标测定及方法 生长性能 在试验第、天上午同一时间，以重复为单位对肉鸡进行称重，记录采食量，计算试验各个时期鸡只的体重、平均日采食量（）、平均日增重（）和料重比（）。肠道 在试验第 天，每个重复选取 只体重接近平均体重的健康肉鸡，屠宰后，打开腹腔，取出并分离肠段，肠道剪 字形口，用 仪依次测定十二指肠、空肠、回肠和盲肠的。每个肠段测 个位置，取平均值。肠道组织形态 在试验第 天，每个重复选取 只体重接近平均体重的健康肉鸡，屠宰后，
9、取出肠道，分别剪取十二指肠、空肠、回肠中段约 肠段，用生理盐水冲洗内容物及残留血液，冲洗后放入 甲醛溶液中固定 以上。在经脱水、透蜡、包埋、切片处理后，用苏木精伊红（）进行染色和封固，在倒置荧光显微镜（，公司，日本）下测定绒毛高度和隐窝深度，计算绒毛高度和隐窝深度的比值（绒隐比，）。肠道紧密连接蛋白 相对表达量的测定 在试验第 天，每个重复选取 只体重接近平均体重的健康肉鸡，屠宰后，取十二指肠、空肠和回肠组织，将所取肠道组织样品放于 冰箱待测。用 法将肠道组织中的总 提取出来，按 （）试剂盒的要求进行反转录，制备，采用 试剂盒进行实时荧光定量，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，选
10、用三磷酸甘油醛脱氢酶（）作为内参基因，根据 法对定量结果进行计算分析。引物序列见表。盲肠微生物区系 将上述在 冰箱保存的盲肠内容物样品送至上海派森诺生物科技有限公司进行微生物区系分析，用 试剂盒从盲肠样品中提取细菌基因组总，鉴定浓度和纯度后，用特异性引物（：；：）对细菌的 的 高变区进行 扩增。采用 平台和 试剂盒对 片段进行双端高通量测序，对测序结果用平台 版本进行分析。首先，使用 软件分别对每个样本计算多样性指数，比较不同样品之间扩增子序列变异（）的丰富度和均匀度；随后，根据 插件降噪去类得到的 划分和分类地位鉴定结果，获得每个样本在各分类水平的具体物种组成情况。动 物 营 养 学 报 卷
11、表 引物序列 基因登录号 引物序列 （）产物大小 密闭蛋白：封闭蛋白：闭合小环蛋白：三磷酸甘油醛脱氢酶：数据统计 试验数据整理后采用 软件进行单因素方差分析（），并采用 氏法进行多重比较，以 为差异显著标准，结果以“平均值标准差”表示。所得的目的基因 相对表达量数据用 软件进行处理，结果以柱状图表示。结 果 蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡生长性能的影响 由表 可知，与 组相比，组和 组的 日龄体重和 日龄、日龄 显著提高（）；组和 组的 日龄 显著降低（），组的 日龄 显著降低（）；组、组、组、组和 组的 日龄 显著降低（），组和 组的 日龄 显著降低（）。与 组相比，组和 组的 日龄 显著提高
12、（），组、组和 组的 日龄 显著提高（）。蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡肠道 的影响 由表 可知，与 组相比，组的空肠 显著降低（）。与 组相比，组、组和 组的空肠 显著提高（）。蛋白酶和益生菌组合添加对肠道组织形态的影响 由表 可知，与 组相比，组、组、组、组和 组的十二指肠及 组的空肠绒毛高度显著提高（），组的回肠绒毛高度显著提高（）；组的十二指肠及 组、组、组和 组的回肠隐窝深度显著降低（）；组 的 十 二 指 肠 及 组和 组的回肠 显著提高（）。与 组相比，组的十二指肠隐窝深度显著降低（），显著提高（）。蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡肠道紧密连接蛋白 相对表达量的影响 由图 可知，与 组
13、相比，组、组、组、组和 组的十二指肠密闭蛋白（）的 相对表达量显著降低（），组和 组的十二指肠封闭蛋白（）的 相对表达量显著提高（）。与 组相比，组的十二指肠 的 相对表达量显著提高（），组和 组的十二指肠 的 相对表达量显著降低（）。与 组相比，组、组和 组的空肠闭合小环蛋白（）的 相对表达量显著提高（）；组和 组的空肠 的 相对表达量显著提高（）；组、组、组和 组的空肠 的 相对表达量显著提高（）。期饶志勇等：蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡生长性能、肠道健康和盲肠微生物区系的影响表 蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡生长性能的影响 项目组别 值 日龄 日龄体重 日龄体重 日龄体重 日龄 平均日采食
14、量 平均日增重 料重比 日龄 平均日采食量 平均日增重 料重比 日龄 平均日采食量 平均日增重 料重比 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（），相同或无字母表示差异不显著（）。下表同。，（），（）动 物 营 养 学 报 卷表 蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡肠道 的影响 项目组别 值十二指肠 空肠 回肠 盲肠 表 蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡肠道组织形态的影响 项目组别 值十二指肠 绒毛高度 隐窝深度 绒隐比 空肠 绒毛高度 隐窝深度 绒隐比 回肠 绒毛高度 隐窝深度 绒隐比 期饶志勇等：蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡生长性能、肠道健康和盲肠微生物区系的影响与 组 相 比，组 的 回 肠 的相对表
15、达量显著提高（），组的回肠 的 相对表达量显著提高（）；组、组和 组的回肠 的 相对表达量显著提高（）。与 组相比，组、组和 组的回肠 的 相对表达量显著提高（），组的回肠 的 相对表达量显著提高（），组和 组的回肠 的 相对表达量显著提高（）。图 蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡肠道紧密连接蛋白 相对表达量的影响 蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡盲肠微生物区系的影响蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡盲肠微生物 多样性的影响 由表 可知，与 组和 组相比，组和 组的 指数显著提高（）。与 组相比，组的 指数显著提高（）；与 组相比，组、组和 组的 指数无显著差异（）。与 组和 组相比，组的 和 指数显著降低
16、（）。动 物 营 养 学 报 卷表 蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡盲肠微生物 多样性的影响 项目组别 值 指数 指数 指数 指数 蛋白酶和益生菌组合添加对肉鸡盲肠微生物门水平物种相对丰度的影响 由图 可知，日龄肉鸡盲肠微生物在门水平的主要微生物菌群有拟杆菌门（）、厚壁菌门（）、互养菌门（）、变形菌门（）、梭杆菌门（）、疣 微 菌 门（）、脱 铁 杆 菌 门（）、蓝藻菌门（）等，其中 和 为优势菌门。与 组相比，组、组、组、组和 组的盲肠 相对丰度无显著差异（），组的盲肠 相对丰度显著提高（）。蛋白酶和益生菌组合添加对盲肠微生物属水平物种相对丰度的影响 由图 可知，日龄肉鸡盲肠微生物在属水平的主要微生物菌群包括拟杆菌属（）、考拉 杆 菌 属（）、粪 杆 菌 属（）、颤螺旋菌属（）、副拟杆菌属（）、巨单胞菌属（）、瘤胃球菌属（）、脱硫弧菌属（）、瘤胃球菌科瘤胃球菌属（）等，其中 和 为优势菌属。与 组相比，组、组和 组的盲肠 相对丰度无显著差异（），组和 组的盲肠 相对丰度显著降低（）；组、组、组和 组的盲肠 相对丰度无显著差异（），组的盲肠 相对丰度相对提高（）；组、组、组和 组的盲肠 无