1、ICS 65.120 B20 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 5742005 饲料中地西泮快速筛选通则 酶联免疫吸附测定法 General Rule of Diazepan Screening in Feeds Enzyme Linked Immunosorbent Assay 2006-01-23 发布 2006-03-01 实施山东省质量技术监督局 发 布 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T5742005 I 前 言 本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。本标准起草单位：山东省饲料监察所。本标准主要起草人：徐强、李会荣、孟凡胜、李俊玲、刘华阳。
2、山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T5742005 1 饲料中地西泮快速筛选通则-酶联免疫吸附测定法 1 范围 本标准规定了用酶联免疫吸附法测定饲料中地西泮的方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中地西泮的快速筛选。本方法的最低定量限为1mg/kg。该方法适合于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新
3、版本适用于本标准。GBT 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 利用物理方法将地西泮抗体吸附于固相载体表面，根据抗原抗体的特异性反应，加入标准或试料提取液及酶标地西泮抗原（已知抗原）与抗体进行特异性的免疫竞争反应。未反应的酶标物在洗涤中被清除，结合的酶标记物可以由显色物显示出来。显色的强弱与样品中的地西泮的量成反比。4 试剂和材料 除非另有说明，本标准所用试剂均由试剂盒厂商提供，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。不同品牌试剂盒试剂组成略有差别。4.1 酶标记的地西泮。4.2 地西泮阳性、阴性对照品。4.3 底物溶液。4.4 甲醇溶液：80%。4.5 终止液。4.6 滤纸
4、。4.7 吸水纸。5 仪器、设备 5.1 酶标板：48 孔或 96 孔；5.2 粉碎机。5.3 天平：感量 0.01g。5.4 漩涡混合器。5.5 离心机：转速000r/min 以上。5.6 离心管：50mL、1.5mL。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T5742005 2 5.7 单道、多道微量加液器。5.8 吸头。5.9 酶标仪。6 试样的制备 取饲料样品1000g，用四分法缩减分取200g左右，粉碎全部过0.45mm孔径筛，充分混匀，装入磨口瓶中备用。7 分析步骤 不同品牌的试剂盒其测定步骤略有差别，使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根据试剂盒说明书略作调整。
5、7.1 试样的提取 称取试料5g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入10mL 甲醇溶液，于漩涡混合器上涡旋3min，3000r/min离心5min。移取适量上清液，用磷酸盐缓冲液稀释，使稀释后的样液处于检测范围内（不超出标准曲线）。7.2 测试程序 7.2.1 将所用酶标板及所有试剂从冰箱中取出，使试剂盒温度升至 20 24oC。注意每种试剂使用前均需摇匀。7.2.2 将足够标准和试料所需数量的酶标板孔条插入微孔架，每个试样和标准需做 2 孔。7.2.3 移取 10L 制备好的试样溶液和标准溶液于各自的微孔中，再加入 100L 酶结合物到每个微孔中，并轻轻震荡使其充分混匀。避光处室温孵
6、育 60min 后，用双蒸水 300L 重复洗板 6 次，最后于吸水纸上拍干酶标扳。7.2.4 每孔加入 100L 底物溶液，并轻轻震荡使其充分混匀，在避光处室温孵育 30min。7.2.5 每孔加入终止液 100L，轻轻震荡混匀。微孔内液体的颜色由蓝色变为黄色。7.2.6 用目测法对样品孔的颜色和限量孔进行比较或用酶标仪进行测定。用酶标仪，在450nm条件下测定标准孔及试料孔吸光度值A，读板过程应在加入终止液后30min内完成。以零标准吸光度值A0为100%计算，折算出各标准和试样的相对吸光度值。以吸光度百分比为纵坐标，对应的各标准溶液浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。根据试样吸光度
7、，查标准曲线得到地西泮的含量（m1）。7.3 结果判定 7.3.1 目测法：如果试样孔颜色与阴性对照孔接近或更深，则判定该样品不含地西泮；如果试样孔比阴性对照孔浅，比限量孔深，则判定该样品含有地西泮，但浓度低于限量；如果试样孔和阳性对照相同，则判定该样品含有地西泮，且浓度等于限量；如果试样孔比阳性对照浅，则判定该样品含有地西泮且浓度高于限量。7.3.2 酶标仪法：测定结果低于限量孔，地西泮含量合格；测定结果等于或大于限量孔，地西泮含量超标，不合格。8 结果计算与表述 8.1 计算公式 试样中地西泮的含量（X）以g/kg表示，按公式(1)计算 DmmX=1 (1)山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T5742005 3 式中:m1从标准曲线上查得的试料提取液中的地西泮的质量，单位为纳克，ng；m 试样质量，单位为克，g；D稀释倍数。8.2 以两次平行测定的算术平均值为测定结果，计算结果保留三位有效数字。9 精密度 9.1 重复性 在同一实验室，两次独立测定结果的相对偏差不大于 20%。9.2 再现性 在不同实验室，两次独立测定结果的相对偏差不大于40%。山东省地方标准公开山东省地方标准公开