1、ICS 65.120 B 46 DB41 河南省地方标准 DB41/T 15872018 饲料中大肠杆菌 O157 的检测 EMA-PCR 法 2018-04-17 发布 2018-07-17 实施河南省质量技术监督局 发 布 河南省地方标准公共服务平台河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15872018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、郑州大学。本标准主要起草人：方忠意、高延玲、李金磊、赵全成、陈小鸽、孟伟、魏法山。本标准参加起草人：董鹏、狄元冉、陈蔷、张艳娜、赵林萍、曾萍、张宁、王庆东、
2、郑彬、李博、彭丽、张磊。河南省地方标准公共服务平台河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15872018 1 饲料中大肠杆菌 O157 的检测 EMA-PCR 法 1 范围 本标准规定了饲料中大肠杆菌 O157 的 EMA-PCR 检测方法。本标准适用于饲料中大肠杆菌 O157 的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/
3、T 14699.1 饲料 采样 3 原理 叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。4 试剂和材料 4.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合 GB/T 6682 一级水的要求。4.2 营养肉汤：见附录 A 的 A.1。4.3 肠道增菌肉汤：见附录 A 的 A.2。4.4 2Premix Taq缓冲液：内含Taq DNA 聚合酶 1.25 U/25 L，4 mmol Mg2+，dNTP 各 0.4 mmol。4.5 特异性引物(对)序列为：a）上游引物：5-CAG
4、GTG AAG GTG GAA TGG TTG T-3；b）下游引物：5-CTC TTT CCT CTG CGG TCC TAG TTA-3。4.6 琼脂糖：电泳级。4.7 Marker 2000。4.8 大肠杆菌 O157 CICC 21530。4.9 50TAE 缓冲液：见附录 A 的 A.3。4.10 6上样缓冲液：见附录 A 的 A.4。4.11 叠氮溴化乙锭（EMA，0.2 mg/mL）：见附录 A 的 A.5。4.12 溴化乙锭（10 mg/mL）。4.13 灭菌离心管：1.5 mL，15 mL。5 仪器设备 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15872018 2 5.1 P
5、CR 仪。5.2 电子天平：感量 0.01 g。5.3 电热恒温培养箱。5.4 离心机：转速12 000 r/min。5.5 浊度仪。5.6 卤素灯：照度25 000 勒克斯（Lux）。5.7 核酸电泳仪。5.8 凝胶成像系统。5.9 微量移液器：0.5 L10 L，10 L100 L，100 L1000 L，1 mL10 mL。5.10 涡旋仪。6 样品采集与制备 按GB/T 14699.1的规定采样，将样品充分混匀后密封低温保存，整个过程避免人为污染。7 检验步骤 7.1 增菌 取25 g试样于225 mL 营养肉汤（4.2）中，充分混匀，36 1 培养6 h进行预增菌，取10 L预增菌液
6、转移至10 mL肠道增菌肉汤（4.3）中，42 1 培养18 h。如果试样量不足25 g，试样质量与增菌液的体积比应为19。7.2 模板的制备 取1 mL增菌液至离心管中，12 000 r/min离心2 min，弃上清。加入1 mL灭菌水悬浮沉淀物，12 000 r/min离心2 min，弃上清，重复洗涤一次。加适量灭菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至0.5麦氏单位（MCF）。取0.2 mL菌悬液至离心管中，加入2 L EMA溶液（4.11）混匀，避光孵育5 min。将离心管开盖置于冰上，卤素灯照射下曝光2 min，然后水浴煮沸10 min，再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却。涡旋混匀裂解物，1
7、2 000 r/min离心2 min，收集上清液，作为PCR扩增的模板（模板制备可选用等效的商品化试剂盒）。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照，用添加大肠杆菌O157阳性标准菌株的样品作为阳性对照，用不含大肠杆菌O157的样品作为阴性对照。7.3 PCR 扩增 采用50 L反应体系：2Premix Taq缓冲液（4.4）25 L，模板5 L，浓度为20 mol/L的上、下游引物各1 L，灭菌水18 L。反应程序为：95 预变性5 min；35个循环：95 变性30 s，60 退火30 s，72 延伸40 s；72 终延伸5 min后4 保存。7.4 电泳检测 PCR 扩增产物 称取1.5 g琼
8、脂糖（4.6）加入100 mL 1TAE电泳缓冲液（4.9）中，加热使其充分熔化，冷至65 左右，加入5 L溴化乙锭（4.12），充分混匀，根据需要在模板内放入合适的梳子，倒入凝胶制成约 5 mm厚的胶块。在电泳槽中加入适量1TAE缓冲液，使液面没过凝胶2 mm左右。取PCR扩增产物5 L8 L河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15872018 3 与1 L 6上样缓冲液（4.10）混合后加入到上样孔内，设Marker 2000（4.7）对照。5 V/cm8 V/cm恒压下电泳20 min30 min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果。8 结果判定 8.1 结果分析条件设
9、定 如果大肠杆菌O157阳性对照的PCR产物在318 bp处出现条带（参见附录B），同时阴性对照PCR产物于318 bp处未出现条带，则检测结果成立；否则结果无效，应重新进行检测。8.2 阳性判定 样品的PCR产物电泳后在318 bp处出现条带，则为疑似阳性样品，此时需按GB 4789.6进行确证，最终结果以后者检测结果为准。8.3 阴性判定 样品的PCR产物电泳后在318 bp处未出现条带，判定25 g样品中未检出大肠杆菌O157。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15872018 4 A A 附 录 A（规范性附录）培养基和试剂 A.1 营养肉汤 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0
10、g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 水 1 000 mL A.1.2 制法 将以上成分混合加热溶解，冷却至25 左右调节至pH7.40.2，分装适当的容器。121 灭菌15 min。A.2 肠道增菌肉汤 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 葡萄糖 5.0 g 牛胆盐 20.0 g 磷酸氢二钠 8.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 煌绿 0.015 g 水 1 000 mL A.2.2 制法 将以上成分混合加热溶解，冷却至25 左右调节至pH7.40.2，分装每管10 mL。115 灭菌20 min。A.3 50TAE电泳缓冲液 A.3.1 成分 三羟甲基氨基甲烷（Tris）242.0
11、 g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2 H2O）37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 灭菌水 942.9 mL A.3.2 制法 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15872018 5 Tris和乙二胺四乙酸二钠溶于800 mL灭菌水，充分搅拌均匀；加入冰乙酸，充分溶解；用1 mol/L NaOH调节至pH8.3，定容至1 L后，室温保存。使用时稀释50倍即为1TAE电泳缓冲液。A.4 6上样缓冲液 A.4.1 成分 溴酚蓝 0.5 g 二甲苯氰FF 0.5 g 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8.0）0.06 mL 甘油 360 mL 灭菌水 640 mL A.4.2
12、 制法 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶于500 mL灭菌水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与甘油混合，定容至1 000 mL，分装后4 保存。A.5 叠氮溴化乙锭（EMA）A.5.1 成分 叠氮溴化乙锭 5 mg 灭菌水 25 mL A.5.2 制法 5 mg叠氮溴化乙锭溶于5 mL灭菌水中，定容至25 mL，充分混匀，分装后-20 避光保存。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15872018 6 B B 附 录 B（资料性附录）大肠杆菌 O157 活菌 EMA-PCR 扩增电泳图 大肠杆菌O157活菌EMA-PCR扩增电泳图参见图B.1。说明：MMarker 2000；1阴性对照；2阳性对照。图B.1 大肠杆菌 O157 活菌 EMA-PCR 扩增电泳图 _ 河南省地方标准公共服务平台