1、ICS 65.020.30 B40 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 6022006 鸡蛋中四环素类残留量的测定 酶联免疫吸附法 Determination of tetyacyclines in egg enzyme linked immunosorbent assay 2005-06-28 发布 2006-07-01 实施山东省质量技术监督局 发 布 山东省地方标准公开山东省地方标准公开山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T6022006 I 前言 本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。本标准起草单位：山东省畜产品质量检测中心。本标准主要起草人：高迎
2、春、陈玲、冯修光、魏秀丽。山东省地方标准公开山东省地方标准公开山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T6022006 1 鸡蛋中四环素类残留量的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了鸡蛋中四环素类残留量的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于鸡蛋中四环素类药物的快速检测。本方法四环素、金霉素的检测限为7.0g/kg。土霉素的检测限为13.0g/kg。该方法适合于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据
3、本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样中四环素类药物与结合在酶标板上的抗原共同竞争抗四环素类药物抗体，再通过与酶标羊抗兔抗体反应，酶标记物将底物转化为有色产物，吸光度值与试样中四环素、金霉素及土霉素浓度成反比。4 材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。4.1 无水甲醇（CH3OH）。4.2 草酸(COOH)22H2O。4.3 柠檬酸（C6H8O7.H2O）。4.4 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）4.5 乙二胺四乙酸二
4、钠（C10H14N2Na2O3）4.6 氢氧化钠溶液，c【（NaOH）】1moL/L：取氢氧化钠 4.0g，加水溶解至 100mL。4.7 草酸甲醇溶液c【（COOH）22H2O）】20mmol/L：取草酸 1.8g,加甲醇至 1000mL。4.8 柠檬酸磷酸氢二钠乙二胺四乙酸二钠缓冲溶液：分别取柠檬酸 12.9g,磷酸氢二钠 10.9g,乙二胺四乙酸二钠 37.2g,加水 900mL 溶解，用 1mol/L 氢氧化钠溶液調 pH 值至 3.8，稀释至 1000mL。4.9 四环素类药物系列标准溶液 4.10 酶标记物 4.11 抗四环素类药物抗体溶液 4.12 底物 4.13 缓冲溶液 4.
5、14 洗液浓缩液 4.15 底物缓冲溶液 4.16 终止液 5 仪器 5.1 分析天平：感量 0.01g。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T6022006 2 5.2 离心机 5.3 微量移液器：单道 1L100L；多道 50L250L 5.4 均质器 5.5 振荡器 5.6 酶标板 5.7 酶标仪 6 测定步骤 使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根据试剂盒说明书略作调整。6.1 试料的提取 取猪肉样品约20g,以10000r/min匀浆2min，称取2g匀浆物（精确至0.01g），加入柠檬酸磷酸氢二钠乙二胺四乙酸二钠缓冲溶液（4.8）8.0mL，于振荡器上震荡30
6、min。10000r/min离心10分钟，上清液备用。C18固相萃取柱依次用无水甲醇（4.1）3mL、水2mL预洗。取备用液5.0mL过柱，用水2mL淋洗。用草酸甲醇液（4.7）1.0mL洗脱，收集洗脱液。将收集的洗脱液摇匀，用稀释液10倍作为试样溶液供酶联免疫法测定。6.2 测试程序 6.2.1 取出酶标板（5.6）及所有试剂，使试剂盒温度升至室温。6.2.2 洗液按 1 份洗液浓缩液(4.14)加 9 份水进行稀释。四环素系列标准溶液（4.9）、抗四环素类药物抗体溶液（4.11）、酶标记物（4.11）、底物溶液(4.12)等按 1 份试剂加 9 份缓冲液进行稀释和制备，稀释液均现配现用。6
7、.2.3 依次向微孔中加入稀释的系列标准溶液(4.9)、空白试料溶液、试样溶液 50uL，稀释的抗体溶液（4.11）50uL，置微型振荡器上振荡 30s，用封口膜封好，孵育 60min。6.2.4 倒出孔内液体,将酶标板（5.4）倒置在吸水纸上拍打,使孔内没有残余液体.用多道移液器加稀释的洗液浓缩液（4.14）250L 到酶联板的微孔内,然后倒出孔内液体,如此重复操作三次。6.2.5 加入稀释的酶结合物 100uL，孵育 30min，按 6.2.4 重复三次。6.2.6 加底物溶液 100ul，避光孵育 15min。6.2.7 用多道移液器每孔加终止液（4.7）100L。6.2.8 将酶标板（
8、5.4）放于酶标仪内,于 450nm 波长处立即测定吸光度值。以零标准吸光度值A0为100%计算，折算出各标准和试样的相对吸光度值。以此吸光度百分比为纵坐标，对应的各标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。待测样品根据其吸光度，查标准曲线得到盐酸克伦特罗的含量（m1）。7 结果计算 试样中四环素类药物浓度的含量（X）以g/kg表示，按公式(1)计算 DmmX=1h(1)式中:m1从标准曲线上查得的试料提取液中四环素类药物的质量，单位为纳克（ng）；m试料质量，单位为克（g）；D稀释倍数；h交叉反应因子。不同药物交叉反应因子见表1 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T6022006 3
9、表1 药物 交叉反应因子 四环素 1 金霉素 1 土霉素 1.85 以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。计算结果保留三位有效数字。8 结果判定 在空白试料中添加土霉素至100g/Kg，各做20个平行样进行测定，重复3次，计算含量平均值和标准差。如被测鸡蛋样品中四环素类药物残留量小于临界值（cut-off value）时，判断为阴性；但检测结果大于等于临界值时，则结果可疑，应用确证法确证。临界值按式（2）计算 L=x 1.64Std (2)式中：L 临界值；X 空白添加样品中土霉素含量平均值；Std空白添加样品中土霉素含量的标准差。9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 20%。山东省地方标准公开山东省地方标准公开