1、 ICS 11.020 C 04 备案号：58313-2018 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 394.52017 代替 DB 22/T 394-2004 保健用品微生物检验方法 第 5 部分：霉菌和酵母菌数测定 Microbiological examine method for health care material Part 5:Determination of molds and yeast count 2017-11-10 发布 2017-12-30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标
2、准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 394.52017 I 前 言 DB22/T 394保健用品微生物检测方法拟分为如下部分：第1部分：菌落总数测定；第2部分：耐热大肠菌群测定；第3部分：铜绿假单胞菌测定；第4部分：金黄色葡萄球菌测定；第5部分：霉菌和酵母菌数测定；本部分为DB22/T 394-2017的第5部分。本部分按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本部分代替DB22/T 394-2004保健用品微生物检验方法，与DB22/T 394-2004相比，结构做了较大调整。
3、除编辑性修改外，主要技术内容变化如下：删除了乙型溶血性链球菌；删除了定量杀菌试验；培养时间由72 h增至5天。本部分由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本部分主要起草人：刘桂华、杨修军、黄鑫、赵薇、张立夫。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：DB22/T 394-2004。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 394.52017 1 保健用品微生物检验
4、方法 第 5 部分：霉菌和酵母菌数测定 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了保健用品中微生物中霉菌和酵母菌数的测定方法。本标准适用生产和经营的保健用品中霉菌和酵母菌数的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义
5、 下列术语和定义适用于本文件。3.1 霉菌和酵母菌数 molds and yeast count 样品在一定条件下培养后，1 g 或 1 mL中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明样品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置28 2 培养5 天，计算所生长的霉菌和酵母菌数。4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。4.1 灭菌生理盐水:详见附录 A.1。4.2 灭菌液体石蜡:详见附录 A.2。4.3 灭菌吐温-80:详见附录 A.3。4.4 虎红培养基:详见附录 A.4。5 仪
6、器和设备 5.1 天平:感量 0.1g。5.2 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 394.52017 2 5.3 高压锅。5.4 量筒:100 mL、200 mL、2000 mL。5.5 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 0.5。5.6 三角烧瓶。5.7 研钵。5.8 振荡器。5.9 灭菌平皿:直径 90 mm。5.10 恒温培养箱:28 2。6 样品 6.1 样品的采集 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
7、检验时，应从不少于2个包装单位的取样中共取10 g（5.1）或 10 mL（5.2）。包装量小于20 g的样品，采样时可适量增加样品包装数量。6.2 注意事项 6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散
8、，所用器皿及材料均应事先灭菌（5.3），全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。6.3 样品的制备 6.3.1 液体样品 水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水（4.1）中，混匀后，制成1:10匀液。油性液体样品，取样品10 g，先加5 mL灭菌液体石蜡（4.2）混匀，再加10 mL灭菌的吐温-80，在40 44 水浴中（5.5）振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL在40 44 水浴中预温），在40 44 水浴中乳化，制成1:10的悬液。6.3.2 膏、霜、乳剂半固体状样品 亲水性的样品，称取10 g，加到装有玻璃珠及90 mL 灭菌生理
9、盐水的三角烧瓶（5.6）中，充分振荡混匀，静置15 min，用其上清液作为1:10的匀液。疏水性样品，称取10 g，放到灭菌的研钵（5.7）中，加10 mL灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状再加入 10 mL灭菌吐温-80，研磨待溶解后，加70 mL 灭菌生理盐水，在40 44 水浴中充分混合，制成1:10匀液。6.3.3 固体样品 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 394.52017 3 称取10 g，加到90 mL灭菌生理盐水中，充分振荡（5.8）混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1:10的匀液。6.
10、3.4 膜状样品 取10 cm2，将膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加100 mL生理盐水，使成10 mL/cm2 浓度，浸泡10 min到15 min，摇匀即得。6.3.5 含抑菌成分检验样品的制备 6.3.5.1 稀释法:用稀释液和培养基将样品稀释到一定浓度，使其抑菌成分的浓度减少到无菌作用的浓度，再进行检验。6.3.5.2 中和法:在检验样品或培养基中加入吐温-80 和卵磷脂作为中和剂，以中和其抑菌效果。6.3.5.3 对吸水膨胀或粘度大的样品，可制成 1:20 样液。7 试验步骤 用灭菌吸管吸取1:10稀释的匀液2 mL，分别注入到两个灭菌平皿（5.9）内，每皿1 mL。另取l mL 注入
11、到9 mL灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100匀液。吸取2 mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1 mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，l:10000等，每种稀释度应换1支吸管。取1:10、1:100、1:1000 的匀液各1 mL分别注入灭菌平皿内，每个稀释度各用2 个平皿，注入融化并冷至45 1 左右的虎红培养基，充分摇匀。凝固后，翻转平板，置28 2（5.10）培养5 天，计数平板内生长的霉菌和酵母菌数，观察并记录。同时做空白对照。8 试验数据处理 先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时
12、，应选取菌落数在 5 50 个范围之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每g（或每 mL）样品中所含的霉菌和酵母菌数。其它范围内的菌落数报告应参照细菌总数的报告方法报告之。每g（或每mL）保健用品含霉菌和酵母菌数以 CFU/g（mL）表示。9 防止污染措施 应按照GB 19489的规定执行。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 394.52017 4 A A 附 录 A（规范性附录）试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。A.1 生理盐水:A.1.1 成分
13、氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.1.2 制法 溶解后，分装10 mL管后，121 高压灭菌20 min。A.2 灭菌液体石蜡 制法:取液体石蜡50 mL，121 高压灭菌20 min。A.3 灭菌吐温-80 制法:取吐温-80 50 mL，121高压灭菌20 min A.4 虎红培养基 A.4.1 成分 蛋白胨 5 g 葡萄糖 10 g 磷酸二氢钾 1 g 硫酸镁（含7H20）0.5 g 琼脂 20 g l/3000虎红溶液 100 mL（四氯四碘荧光素）蒸馏水 1000 mL 氯霉素 100 mg A.4.2 制法 将上述各成分（除虎红外）加入蒸馏水中溶解后，再加入虎红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121 高压灭菌20 min。若无氯霉素，使用时每1000 mL 加链霉素30 mg。_ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印