1、ICS 65.150 B 51 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 31202019 水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA 分子标记法 Technical specification for species molecular identification using COI and 16S rRNA of aquatic animals 2019-02-28 发布 2019-03-28 实施 辽宁省市场监督管理局 发 布 DB21/T 31202019 I 前 言 本标准依据GB/T 1.12009给出的规则制定。本标准由大连市质量技术监督局提出。本标准由辽宁省农业农村厅归口。
2、本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。附录A、B、C为资料性附录。DB21/T 31202019 1 水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA 分子标记法 1 范围 本方法规定了水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法的相关术语和定义，标记方式，试剂、仪器和设备，样品采集、保存和前处理，DNA提取和检测，序列扩增和测序，以及物种鉴定的方法。本方法适用于水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
3、凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 水产动物物种分子鉴定 aquatic species molecular identification 指利用分子生物学手段,对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本）的分子标记进行分析，鉴定生物种类的过程。3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合
4、成特异DNA片段的过程。3.3 DNA序列测定 DNA sequencing 测定DNA分子的核苷酸序列。3.4 序列比对 alignment 为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性，将他们按照一定的规律进行排列。3.5 DB21/T 31202019 2 DNA条形码-COI 细胞色素c氧化酶亚基I（cytochrome c coxidase subunit I）。3.6 16S rRNA 16S核糖体核糖核酸（16S ribosomal RNA）。4 标记方式 水产动物的COI和16S rRNA的DNA序列进化速度较快，同时又相对保守，可作为分子标记条形码用于物种鉴定。通过PCR技术扩增
5、水产动物的COI和16S rRNA基因部分序列，测序后在已知数据库中进行序列比对，确定物种分类信息。本方法同时对COI和16S rRNA两种分子标记条形码进行分析，并在GenBank（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）和BOLD System（http:/www.boldsystems.org）两个数据库中比对，确保鉴定成功率和准确率。5 试剂、仪器和设备 5.1 试剂 实验仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T 6682一级水要求。主要包含以下内容：无水乙醇；95%乙醇；TE 缓冲液（pH 7.6）（100 mol/L Tris-Cl，pH 7.6；10 m
6、mol/L EDTA，pH 8.0）；Taq 酶（5 U/L）；超纯水；10PCR 缓冲液（500 mmol/L KCl；100 mmol/L Tris-Cl，pH 8.3；15 mmol/L MgCl2）；引物（10 mol/L）；dNTP 混合液（每种脱氧核糖核苷三磷酸浓度 2.5 mmol/L）；溴化乙锭（10 mg/mL）；琼脂糖；电泳标记物（markers）；平衡酚；氯仿/异戊醇（24:1）；10Tris 硼酸（10TBE）电泳缓冲液；灭菌蒸馏水；液氮；细胞裂解液（20 mmol/L）。5.2 仪器和设备 实验用仪器和设备主要包含以下内容：凝胶成像分析系统；PCR 仪；低温高速离心机
7、（4，12000 转）；DB21/T 31202019 3 稳压稳流电泳仪；单道可调移液器；电子天平（0.001 g）；水浴恒温震荡器；电泳槽；紫外分光光度计；遗传分析仪。6 样品采集、保存和前处理 6.1 样品采集、保存 样本采集和后续实验应在生物安全实验室进行。选择DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、肠道、体腔液、鱼鳍等组织进行采样，样品可通过-20冷冻、或4冰鲜等方式暂时保存。6.2 样品前处理 将样品切成5 mm左右直径的小块或薄片，用灭菌蒸馏水洗净，按1:10左右比例将样品放入盛有95%乙醇的离心管中，4 保存。7 DNA 提取和检测 7.1 DNA 提取 7.1.1 取 0.1 g
8、左右样品置于陶瓷研钵中，加少许液氮研碎。将粉末转入 400 L500 L 细胞裂解液离心管中，37 温浴 1 h 后转入 50 水浴 3 h，期间经常摇动。7.1.2 反应液冷却后加 500 L 平衡酚，缓慢颠倒 10 min 混匀。12000 rpm 离心 15 min，转上层水相于新离心管中（重复此过程一次）。7.1.3 加氯仿/异戊醇 450 L，混匀后 12000 rpm 离心 10 min。转上层水相于新离心管中，加 1/10 体积 3 mol/L NaAc 和 2.5 倍体积无水乙醇，混匀，置于-20 环境下 1 h。7.1.4 12000 rpm 离心 15 min，弃上清。以
9、70%冷乙醇洗涤 12 次，真空抽干或自然吹干，加入 TE 缓冲液溶解，-20 保存。7.2 DNA 检测 7.2.1 纯度检测 吸取1 L3 L DNA，琼脂糖凝胶100 V电泳30 min，如条带整齐、亮度高，则纯度满足实验要求。7.2.2 浓度检测 分别于260 nm和280 nm波长下测定DNA的紫外吸收值。DNA浓度(g/mL)=A260/(0.020L)稀释倍数，式中L为比色池厚度，单位cm。DNA浓度在10 g/mL以上时进行后续实验。8 序列扩增和测序 DB21/T 31202019 4 8.1 引物 水产动物PCR扩增引物参见附录A。8.2 PCR 扩增 PCR扩增应在以下体
10、系和条件下进行：PCR 扩增体系：10PCR 缓冲液 10 L、上下游引物各 1 L、DNA 提取液 5 L、Taq 酶 0.5 L，dNTP 混合液 8 L、超纯水定容至 50 L；PCR 扩增条件：一个循环反应（95 5 min），30 个循环反应（94 30 s，50 30 s，72 60 s），72 10 min，结束 PCR 反应。8.3 测序 利用遗传分析仪对PCR产物进行双向测序，得到DNA序列信息。9 物种鉴定 9.1 序列比对鉴定 将COI基因序列在GenBank和BOLD System中进行核苷酸序列比对，将16S rRNA基因序列在GenBank中进行核苷酸序列比对。比对
11、结果认定如下：序列比对检出标准为序列相似度99%；综合 COI 和 16S rRNA 的比对结果形成最终鉴定结果；若出现 2 个及以上比对结果，则选取相似度高且结果一致的鉴定物种作为鉴定结果；对于鉴定成功的样本，记录于水产动物物种分子鉴定记录表（见附录 B）；对于无匹配结果，或结果矛盾的样本，作为未检出样本处理。9.2 未检出样本 未检出样本记录于未检出水产动物分类记录表（详见附录C）。DB21/T 31202019 5 A A 附 录 A（资料性附录）水产动物物种分子鉴定 PCR 扩增引物 表A.1 水产动物物种分子鉴定PCR扩增引物 物种 引物序列 COI基 因PCR 扩增引物 硬骨鱼纲
12、软骨鱼纲 F:5-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3 R:5-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3 甲壳纲 F:5-TATTATTAGACAAGAATCTGGTAAA-3 R:5-AGGAAATGTTGAGGGAAGAAAGTAA-3 双壳纲 腹足纲 F:5-ACAAATCAYAARGAYATYGG-3 R:5-ACCAATCATAAAGATATTGG-3 头足纲 F:5-ACAAAYCATAAAGAYATTGG-3 R:5-GTAAATATATGRTGGGCTCA-3 海参纲 海胆纲
13、 海星纲 F:5-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3 R:5-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3 钵水母纲 F:5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC-3 R:5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 哺乳纲 F:5-TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3 R:5-CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3 爬行纲 F:5-ACTCAGCCATCTTACCTGTGATT-3 R:5-TGGTGGGCTCATACAATAAAGC-3 通
14、用（选用）F:5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 R:5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 16S rRNA 基因 PCR 扩增引物 通用（除 甲 壳纲 和 头 足纲）F:5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3 R:5-TCCATAGGGTCTTCTCGTC-3 甲壳纲 F:5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3 R:5-TCCATAGGGTCTTATCGTC-3 头足纲 F:5-CCCGCCTGTTTACCAAAAACAT-3 R:5-TCCATAGGGTCTTTTCGTC-3 注：COI基因PCR扩增引物可选用特异
15、引物或通用引物。DB21/T 31202019 6 B B 附 录 B（资料性附录）水产动物物种分子鉴定记录表 表B.1 水产动物物种分子鉴定记录表 鉴定人 ；地点 ；时间 年 月 日 时 分至 年 月 日 时 分 序号 样本编号 样品名称 样品来源 鉴定结果 备注 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 记事：采样人 记录人 校对人 DB21/T 31202019 7 C C 附 录 C（资料性附录）未检出水产动物分类记录表 表C.1 未检出水产动物分类记录表 鉴定人 ；地点 ；时间 年 月 日 时 分至 年 月 日 时 分 序号 样本编号 样品名称 样品来源 未检出结果 备注 1 2 3
16、 4 5 6 7 8 9 10 记事：采样人 记录人 校对人 DB21/T 31202019 1 参 考 文 献 1 Mitani T,Akane A,Tokiyasu T,et al.Identification of animal species using the partial sequences in the mitochondrial 16S rRNA gene.Legal medicine,2009,11:S449-S450.2 Lakra W S,Goswami M,Gopalakrishnan A.Molecular identification and phylogenetic relationships of seven Indian Sciaenids(Pisces:Perciformes,Sciaenidae)based on 16S rRNA and cytochrome c oxidase subunit I mitochondrial genes.Molecular Biology Reports,2009,36(5):831-839.3 Nationa