1、 ICS 65.020.20 B 05 备案号：54204-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 25272016 转基因玉米中cry1A基因定性检测 PCR法 Qualitative detection for cry1A genes in genetically modified maize PCR method 2016-12-09 发布 2017-03-01 实施 吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25272016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1
2、.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省农业科学院。本标准主要起草人：李飞武、邵改革、夏蔚、闫伟、董立明、李葱葱。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25272016 1 转基因玉米中 cry1A 基因定性检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了转基因玉米中 cry1A 基因定性检测 PCR 法的术语和定义、原理、试剂或材料、试验条件、仪器设备、样品、试验步骤、结果分析与表述、检出限。本标准适用于转基因玉米 MON8
3、10、MON89034、Bt11、Bt176、Bt506、C0030.3.5、双抗 12-5 转化体及其衍生品种的植株、籽粒及以玉米为唯一原料的玉米初加工品中的 cry1A 基因的普通 PCR 定性检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 农业部 1485 号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部 1861 号公告3201
4、2 转基因植物及其产品成分检测 玉米内标准基因定性 PCR 方法 农业部 2031 号公告192013 转基因植物及其产品成分检测 抽样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 zSSIIb 基因 zSSIIb gene 编码玉米淀粉合酶异构体 zSTSII-2 的基因，在本标准中作为玉米的内标准基因。3.2 cry1A 基因 cry1A gene 编码苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）Cry1A 杀虫晶体蛋白的一类基因。4 原理 根据转基因玉米中 cry1A 基因保守序列设计特异性引物，对试样进行 PCR 扩增。依据是否扩增获得预期 330 bp 的
5、DNA 片段，判断样品中是否含有 cry1A 基因成分。5 试验条件 常温条件下。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25272016 2 6 试剂或材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。6.1 琼脂糖。6.2 10 g/L 溴化乙锭（EB）溶液：称取 1.0 g 溴化乙锭，溶解于 100 mL 水中，避光保存。警告溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。注：可选择其他的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。6.3 10 mo
6、l/L 氢氧化钠（NaOH）溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容到 200 mL。6.4 500 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠，加入 70 mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（6.3）直至 EDTA-Na2 完全溶解，用氢氧化钠溶液（6.3）调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。6.5 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基
7、甲烷溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。6.6 TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（6.5）和 2 mL 乙二胺四乙酸二钠溶液（6.4），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。6.7 50TAE 缓冲液：称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用 500 mL 水加热搅拌溶解后，加入 100 mL 乙二胺四乙酸二钠溶液（6.4），用冰乙酸调 pH 至 8.0，然后加水定容到 1 0
8、00 mL。使用时用水稀释成 1TAE。6.8 加样缓冲液：称取 250.0 mg 溴酚蓝，加入 10 mL 水，在室温下溶解 12 h；称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝，加 10 mL 水溶解；称取 50.0 g 蔗糖，加 30 mL 水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至 100 mL，在 4 下保存。6.9 DNA 分子量标准：可以清楚的区分 100 bp 1 000 bp 的 DNA 片段。6.10 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。6.11 Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液及
9、25 mmol/L 氯化镁溶液。6.12 zSSIIb 基因引物：按农业部 1861 号公告32012 中给出的普通 PCR 引物：zSSIIb-F：5-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3 zSSIIb-R：5-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3 注：预期扩增片段大小为 151 bp。6.13 cry1A 基因特异性序列引物：Cry1A-F：5-ACCGGYTACACYCCCATCGACATC-3 Cry1A-R：5-GGCGSWGTTCATGTCGTTGAA-3 注1：预期扩增片段大小为 330 bp。注2：Y 表示碱基 C 或 T，S 表示碱基 C 或 G，W
10、 表示碱基 A 或 T。6.14 引物溶液：用 TE 缓冲液（6.6）或水分别将上述引物稀释到 10 mol/L。6.15 DNA 提取试剂盒。6.16 定性 PCR 试剂盒。7 仪器设备 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25272016 3 7.1 PCR 扩增仪：升降温速度 1.5/s，孔间温度差异 1.0。7.2 凝胶成像系统或照相系统。7.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。7.4 紫外透射仪。7.5 分析天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg。8 样品 8.1 抽样 按 NY/T 672 和农业
11、部 2031 号公告192013 的规定执行。8.2 试样制备 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 的规定执行。8.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告42010 的规定执行。9 试验步骤 9.1 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告42010 的规定执行。9.2 PCR 扩增 9.2.1 试样 PCR 扩增 9.2.1.1 玉米内标准基因 PCR 扩增 按农业部 1861 号公告32012 中 7.5.1.1.1 的规定执行。9.2.1.2 cry1A 基因 PCR 扩增 9.2.1.2.1 每个试样 PCR 设置 3 次平行。9.2.1.2.2 在
12、PCR 管中按表 1 依次加入反应试剂，混匀。也可采用经验证的、等效的定性 PCR 试剂盒配制反应体系。表1 PCR 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L）各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L Cry1A-F 0.2 mol/L 0.5 L 10 mol/L Cry1A-R 0.2 mol/L 0.5 L 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T
13、 25272016 4 表 1 续 试剂 终浓度 体积 Taq DNA 聚合酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA 模板 2.0 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 注1：“”表示体积不确定，如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据 Taq DNA 聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。注2：若采用定性 PCR 试剂盒，则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系，但上下游引物用量按表 1 执行。9.2.1.2.3 将 PCR 管放在离心机上，500 g 3 000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中
14、。9.2.1.2.4 进行 PCR 反应。反应程序为：94 变性 5 min；94 变性 30 s，60 退火 30 s，72 延伸 30 s，共进行 35 次循环；72 延伸 7 min。9.2.1.2.5 反应结束后取出 PCR 管，对 PCR 反应产物进行电泳检测。9.2.2 对照 PCR 扩增 9.2.2.1 在试样 PCR 扩增的同时，应设置 PCR 阴性对照、PCR 阳性对照和 PCR 空白对照。9.2.2.2 以非转基因玉米基因组 DNA 作为阴性对照的模板；以转 cry1A 基因玉米质量分数为 0.1%1.0%的玉米基因组 DNA 溶液作为阳性对照的模板；以水作为空白对照的模板
15、。9.2.2.3 除模板外，对照 PCR 扩增与试样 PCR 扩增相同。9.3 PCR 产物电泳检测 按 20 g/L 的质量浓度称量琼脂糖，加入 1TAE 缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每 100 mL 琼脂糖溶液中加入 5 L EB 溶液或适量的核酸染料，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入 1TAE 缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取 10 L PCR 产物与 2 L 加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入 DNA 分子量标准，接通电源在 2 V/cm 5 V/cm 条件下电泳检测。9.4 凝胶成像分析 电泳结束后，取出琼脂糖
16、凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据 DNA 分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。10 结果分析与表述 10.1 对照检测结果分析 阳性对照 PCR 中，玉米内标准基因和 cry1A 基因序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出玉米内标准基因片段，空白对照中没有预期扩增片段，表明 PCR 检测反应体系正常工作。否则，重新检测。10.2 样品检测结果分析和表述 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25272016 5 10.2.1 玉米内标准基因和 cry1A 基因序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出 cry1A 基因成分，表述为“样品中检测出 cry1A 基因成分，检测结果为阳性”。10.2.2 玉米内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而 cry1A 基因序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出 cry1A 基因成分，表述为“样品中未检测出