1、 ICS 11.020 C 05 备案号：58327-2018 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 396.82017 代替 DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 8 部分：小鼠精子畸形试验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 8:Sperm abnormality test in mice 2017-11-10 发布 2017-12-30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印
2、本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.82017 I 前 言 DB22/T 396保健用品毒理学评价程序与检验方法拟分为如下部分：第 1 部分：评价程序；第 2 部分：急性经皮毒性试验；第 3 部分：长期经皮毒性试验；第 4 部分：皮肤刺激性试验；第 5 部分：皮肤变态反应试验；第 6 部分：细菌回复突变试验；第 7 部分：啮齿动物微核试验；第 8 部分：小鼠精子畸形试验；第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验；第 10 部分：致畸试验；
3、第 11 部分：致癌试验；第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。本部分为DB22/T 396-2017的第8部分。本部分按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本部分代替DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法，与DB22/T 396-2014相比，结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术变化如下：增加了警示；增加了范围；修改了实验动物；增加了仪器和试剂；修改了染毒方式；本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本部分主要起草人：张晶莹、孙兰、孟令仪、宋昕恬、吴晓刚、隋自洁、高峰。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：DB22
4、/T 396-2004；DB22/T 396-2014。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.82017 1 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 8 部分：小鼠精子畸形试验 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能得安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施。并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了保健用品毒理学精子畸形评价方法。本标准
5、适用于保健用品毒理学精子畸形检验方法。2 精子畸形试验 2.1 实验动物 健康成年雄性小鼠，周龄为7 周12 周，体重25 g35 g，一般每组至少5 只。试验前在实验动物房至少适应3 天5 天。2.2 仪器和试剂 2.2.1 仪器 2.2.1.1 解剖器械。2.2.1.2 电子天平。2.2.1.3 离心机。2.2.1.4 冰箱。2.2.2 试剂 2.2.2.1 0.1%秋水仙素 置于棕色瓶中，冰箱保存。2.2.2.2 60%冰乙酸 取60 ml冰乙酸(分析纯)，加蒸馏水至100 ml。2.2.2.3 1%柠檬酸三钠 取1 g柠檬酸三钠(分析纯)，加蒸馏水至100 ml。2.2.2.4 固定液
6、 甲醇：冰乙酸=3:1，现用现配。2.2.2.5 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)磷酸氢二钠溶液(1/15 mol/L):磷酸氢二钠（Na2HPO4,分析纯）9.47 g溶于 1000 ml 蒸馏水中。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.82017 2 磷酸氢二钾溶液(1/15 mol/L)：磷酸氢二钾溶液（KH2PO4,分析纯）9.07 g溶于 1000 ml 蒸馏水中。取磷酸二氢钠(1/15 mol/L)：80 ml与磷酸氢二钾溶液(1/15 mol/L)20 ml 混合，调pH至7.4。2.2.
7、2.6 Giemsa 染液 称取Giemsa 染液3.8 g，加入375 ml甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后再加入125 ml甘油。置于37 恒温箱保温48 h振摇数次。过滤两周后用。2.2.2.7 Giemsa 应用液 取一份 Giemsa 染液与 9 份 磷酸盐缓冲液混合而成，现用现配。2.3 剂量选择和动物分组 设1/2、1/5、1/10、和1/20 LD50剂量组以及阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，剂量为40 mg/kg体重。阴性对照组为溶剂对照。2.4 染毒方式 经皮给予受试物，连续5 d，每天一次。动物处死前3 h5 h腹腔注射秋水仙素4 mg/kg6 mg/
8、kg 体重(注射体积：10 ml/kg体重6 mg/kg 体重)。秋水仙素宜现用现配。2.5 试验方法 试验步骤：a)于染毒后 4 周用颈椎脱臼的方式处死动物，剖腹，取出附睾；b)将附睾放入盛有 2 ml 生理盐水的小平皿中，用眼科剪刀剪碎；c)以四层擦镜纸过滤，滤液涂片，自然干燥；d)将玻片置甲醇中固定 5 min，用 2.5%伊红染色 1 h，封片。在显微镜（4010）下计数2000 个精子中畸变的精子数，精子畸形，主要表现在头部，其次为尾部，畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。异常精子均应记录显微镜的坐标数，以备查询。以便统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。判断双头，双尾畸形时，要注意与二条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。3 结果评价 每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行参数统计比较，精子畸形阳性的标准是，畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著性意义，并有剂量反应关系（一般阴性对照组的精子异常率为0.8%3.4%）。_ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印