1、ICS 65.020.01 B 05 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 23412014 马铃薯种薯（种苗）病毒多重 RT-PCR 检测技术规程 2014-07-05 发布 2014-09-05 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 23412014 1 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由沈阳市农业科学院提出。本标准由沈阳市质量技术监督局归口。本标准起草单位：沈阳市农业科学院、辽宁省农业科学院、铁岭市农产品质量安全检验检测中心。本标准主要起草人：杨双、潘菊、左丽君、岳玲、王辉、李金凤、马东梅、刘延斌、孙嘉兴、李雪。DB21/T 2341201
2、4 2 马铃薯种薯（种苗）病毒多重 RT-PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯种薯（种苗）的总RNA提取、多重RT-PCR扩增、电泳检测及结果判定的方法和操作规程。本标准适用于马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 18133-2012 马铃薯种薯 GB/T 29377-2012 马铃薯脱毒种薯级别与检验规程 3 术语和定义 下列术语及定义适用于本标准。3.1 马铃薯 Y 病毒（potato virus
3、Y，PVY）马铃薯Y病毒(Potato virus Y,简称PVY)，在马铃薯上引起严重花叶或坏死斑和坏死条斑。PVY是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的主要成员，病毒粒体线形，长730nm，该病毒寄主范围较广，可侵染茄科多种植物。病毒基因组为9.7Kb的单链正义RNA，基因组5端共价结合基因组连接蛋白（VPg），3端含有Ploy A尾巴，该基因组为一个长的开放读码框（ORF），可翻译成一个多聚蛋白，随后切割产生810个产物。3.2 马铃薯 A 病毒（potato virus A，PVA）马铃薯A病毒(Potato virus A,简称PVA)，在马铃薯上引起轻花叶或不显症。PVA是马铃薯
4、Y病毒属（Potyvirus）成员，病毒粒体线形，长730nm，其寄主范围较窄，仅侵染茄科少数植物。病毒基因组为近1Kb的单链正义RNA，基因组5端共价结合基因组连接蛋白（VPg），3端含有Ploy A尾巴，该基因组包含一个开放读码框（ORF），可翻译成一个多聚蛋白，随后切割产生11个产物。3.3 DEPC 水（DEPC-Treated Water）DB21/T 23412014 3 DEPC是焦碳酸二乙酯,分子式为C6H10O5，分子量为162.14，通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性，常用于生物实验中RNA的提取等。DEPC水指经过是指用DEPC处理过
5、并经高温高压消毒的纯水。3.4 反转录-聚合酶链式反应 RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应，实现扩增RNA上特异片段的技术。3.5 cDNA 互补DNA，指与单链RNA互补的DNA，此为单链cDNA分子，或以此单链DNA为模板合成另一条与其互补的单链DNA,两条互补的单链DNA分子组成一个双链cDNA分子。4 原理 本标准涉及的马铃薯Y病毒（PVY）和马铃薯A病毒（PVA）属于单链正义RNA病毒，在宿主内以RNA形式存在，通过提取待测植物组
6、织总RNA,利用2对引物的多重RT-PCR方法扩增2种病毒的特异序列，通过琼脂糖电泳检测目标条带的有无，确定是否感染相应病毒。5 仪器设备及试剂 5.1 仪器设备 PCR仪；水平电泳槽；电泳仪；万分之一电子天平；微量加样器；恒温水浴锅；磁力搅拌器；高速冷冻离心机；紫外-可见成像系统；高压灭菌锅；pH计等。5.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；硼酸；盐酸（HCl，36%）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；氯化锂溶液（LiCl，10 mol/L，RNase-free）；氢氧化钠（NaOH）；-巯基乙醇；无水乙醇；M-MLV Reve
7、rse Transcriptase（200 units/L）；Oligo（dT）15（10 mol/L）；（dN）9（10 mol/L）；dNTPs（10 mmol/L）；RNase inhibitor（40 units/L）；二硫苏糖醇（100 mM）；2Taq PCR Mix(with Dye)；引物；DEPC水；琼脂糖；Gold View染料等。5.3 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。6 方法步骤 6.1 抽样 按照GB/T 29377-2012的规定进行抽样。DB21/T 23412014 4 6.2 总 RNA 提取 6.2.1 组织裂解 将少量样品（植物叶片、块茎芽眼或者脱毒种
8、苗茎叶）在液氮中迅速研碎，取约0.05 g加入盛有500 L CTAB提取RNA缓冲液的2 mL离心管中，振荡混匀后于65水浴10 min。6.2.2 去蛋白质 加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提，4 10,000 rpm离心5 min后，将上清液转移至1.5 mL离心管。6.2.3 沉淀 RNA 加入总体积1/4的10 mol/L LiCl，-20放置2 h后，4 10,000 rpm离心10 min，弃上清。6.2.4 去多糖、盐等杂质 用DEPC水溶解沉淀，加入总体积1/10的3 mol/L NaAC（pH 5.2）混匀，再加入2倍体积无水乙醇，-20放置20 min，4 10,00
9、0 rpm离心10 min，弃上清。70%乙醇洗涤沉淀2次，放置超净工作台上吹干，加入50 L DEPC水溶解。6.3 多重 RT-PCR 扩增 6.3.1 cDNA 合成 20 L 体系：DEPC水6.5 L，Oligo d（T）15（10 mol/L）2 L；（dN）9（10 mol/L）2 L；dNTPs（10 mmol/L）1 L；提取的RNA 1 L，置于65 5min，立刻冰浴3 min，再加入5M-MLV Buffer 4 L，RNase inhibitor（40 units/L）0.5L；二硫苏糖醇（100 mM）2 L；M-MLV Reverse Transcriptase（
10、200 units/L）1L。37 2h，94 5 min，立刻置于-20保存。6.3.2 PCR 扩增 6.3.2.1 反应体系 总体积 10 L，包括 5 L 2Taq PCR Mix(with Dye)、1L PVY F 引物（10 mol/L）、1L PVY R 引物（10 mol/L）、1L PVA F 引物（10 mol/L）、1L PVA R 引物（10 mol/L）、1L cDNA，混匀。引物序列见附录 B。6.3.2.2 反应程序 94预变性 5min；94变性 40s，60退火 35s，72延伸 45s，循环 35 次；72延伸5min；4保存。6.4 电泳检测 6.4.1
11、 凝胶制作 称取0.48g琼脂糖倒入150ml三角瓶中，加入30ml 1TBE缓冲液，在微波炉中加热溶解后，再加入3l Goldview生物染料，倒入调平并安放适当梳齿的制胶板上，冷凝后小心拔出梳齿。6.4.2 电泳 DB21/T 23412014 5 每个加样孔加入5 L PCR产物。100 V恒压电泳至指示带到达胶板的2/3处。6.4.3 观察 电泳结束后，取出凝胶置于紫外成像系统，拍照。6.5 结果判定 观察PCR产物的有无和片段大小，与阳性对照、阴性对照比较。如果检测样品与阳性对照相同具有目标条带，判定样品感染相应病毒；如果检测样品与阴性对照相同无目标条带，判定样品没有感染相应病毒。D
12、B21/T 23412014 6 A A 附 录 A（规范性附录）溶液配制 A.1 CTAB提取RNA缓冲液 包含 2%CTAB(W/V)，25 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），2.0 mol/L NaCl，灭菌后加入 2%（V/V）-巯基乙醇。A.2 引物稀释 按照引物合成单的说明先配制100 mol/L的储存液，取适量储存液稀释10倍，配制浓度为10mmol/L的使用液。A.3 10 倍电泳缓冲液 Tris 108g，硼酸55g，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液37 mL，定容至1000 mL。DB21/T 23412014 7 B B 附 录 B（规范性附录）引物序列 序号 引物名称 序列 目标条带大小（bp）1 PVY Primer F:ACGTCCAAAATGAGAATGCC R:TGGTGTTCGGTGATGTGACCT 480 2 PVA Primer F:GTTGGAGAATTCAAGATCCTGG R:TTTCTCTGCCACCTCATCG 255 _