1、ICS 65.120 B 46 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 13612011 饲料中氯霉素的测定气相色谱质谱法 Determination of chloramphenicol in feed Gas chromatography mass spectrometry method 2011-03-16 发布 2011-04-16 实施安徽省质量技术监督局 发 布DB34/T 13612011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质
2、量安全检测中心)。本标准主要起草人：刘红云、蔡一杰、吴蕾、明文庆、张莉、丁作坤、陶小平、钱志平、吴昊。DB34/T 13612011 1 饲料中氯霉素的测定气相色谱质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中氯霉素检验的气相色谱质谱测定方法。本标准适用于饲料中氯霉素的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 试样制备 按 GB/T 14699.1 抽取有代表性的饲料样品，
3、用四分法缩减取约 200 g，粉碎至过 0.45 mm 孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。4 原理 饲料经磷酸缓冲液均质后，用乙酸乙酯提取。用硅胶和C18 固相萃取柱对乙酸乙酯提取物进行净化和富集。用N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）衍生化，供气相色谱质谱进行定性和定量分析。5 试剂和溶液 5.1 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 二级水的规定。5.2 氯霉素标准品：纯度99。5.3 标准储备液：准确称取氯霉素标准品适量，用甲醇溶解配制成 100 g/mL，作为标准储备溶液。4 冰箱保存，有效期 1 个月。5.4 标准工
4、作液：精密量取适量氯霉素储备液，用甲醇稀释成浓度为 0.5、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL 的标准工作液。4 保存 7 天。5.5 衍生化试剂：N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷 TMCS（99:1）。5.6 pH 6.8 磷酸缓冲液：取 0.2 mol/L 磷酸氢二钾溶液 250 mL，加 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液 118 mL，加水使溶解成 1000 mL，摇匀，即得。5.7 甲醇：色谱纯。5.8 乙腈：色谱纯。5.9 乙酸乙酯：色谱纯。DB34/T 13612011 2 5.10 二氯甲烷。5.11 正己烷。5.12
5、气相色谱质谱淋洗液：二氯甲烷正己烷=（1：1）。5.13 固相萃取柱：规格 500 mg/6mL，填料 C18。5.14 硅胶固相萃取柱：规格 1000 mg/6mL。5.15 微孔滤膜：孔径 0.25 m，有机相。6 仪器设备 6.1 气相色谱质谱仪。6.2 高速冷冻离心机，不低于 10000 rmin。6.3 饲料粉碎机。6.4 氮吹仪。6.5 旋转蒸发仪。6.6 固相萃取装置。6.7 分析天平，感量 0.0001 g，0.001 g。6.8 振荡器。6.9 涡旋混合器。6.10 超声波清洗机。6.11 离心管，50 mL。6.12 梨形瓶，50 mL。6.13 单通道可调移液器：110
6、L、550 L、50200 L、2001000 L。7 测定步骤 7.1 试样提取 称取粉碎后的饲料样品 5 g（精确至 0.001 g）于 50 mL 离心管中，加入 l0 mL pH 6.8 磷酸缓冲液，混合均匀。用 30 mL 乙酸乙酯分 3 次提取，振荡 30 min，10000 rmin 离心 5 min，合并提取液，在 55 水浴下旋蒸掉大部分溶剂，剩余的溶剂用氮气吹至近干，用 5 mL 5 乙腈水溶液溶解残留物。7.2 净化 硅胶固相萃取小柱依次用 5 mL 乙腈、5 mL 淋洗液活化；（7.1）项下的提取液残留物上样；5 mL气相色谱质谱淋洗液淋洗，5 mL 20乙腈水溶液洗脱
7、。用 6 mL 乙酸乙酯分三次提取洗脱液，合并提取液并吹干，用 5 mL 5乙腈水溶液溶解残留物，待C18固相萃取柱进一步净化。C18小柱依次用 5 mL 乙腈、5 mL 水活化，上样，5 mL 水淋洗，5 mL 乙腈洗脱，收集洗脱液备用。7.3 样品衍生化 用氮气吹干上述乙腈洗脱净化液，加入 100 L 衍生试剂，密封后 70 衍生 1 h，氮气吹干，加 0.5 mL 正己烷溶解。同时分别取标准工作系列（5.3）1 mL 用氮气吹干后，加入 100 L 衍生试剂，按试样同法操作。待气相色谱质谱分析。7.4 气相条件 DB34/T 13612011 3 色谱柱：5苯基甲基聚硅氧烷，柱长 30
8、m，内径 0.25 mm，膜厚 0.25m 或性能相当的色谱柱。进样口温度：250。升温程序：起始温度 100（保持 1 min），以 30/min 的速率升温至 280（保持 9 min）。载气：氦气纯度 99.999。流量：0.8 mLmin。进样方式：不分流进样。进样体积：1.0 L。7.5 质谱条件 样品离子源：负化学电离源（反应气为甲烷）。甲烷：纯度 99.999。离子源温度：150。传输线温度：250。检测电压：500V。选择离子收集模式：收集质荷比为 73，147，221，281，355，429 m/z 的 6 个碎片离子。7.6 上机测定 取标准工作液和样品试液分别注入气相色谱
9、质谱仪记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。8 定性定量方法 定性方法：样品与标准品保留时间的相对标准偏差不大于 0.5。特征离子基峰丰度与标准品相差不大于 20。定量方法：以 73，147，221，281，355，429 峰面积之和进行校正定量。9 结果计算 按照下式计算试样中药物残留的含量：A CsVXAsm=.(1)式中：X 中药物的含量，单位为微克每千克（g/kg）；A 样溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值；As准溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值；V 容体积，单位为毫升（mL）；Cs准溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；m 样质量，单位为克（g）。计算结果扣除空白值，平行测定结果用算术平均值表示，结果保留 3 位有效数字。10 检测方法灵敏度、准确度、精密度 10.1 灵敏度 DB34/T 13612011 4 本方法的检测限为 0.1 g/kg。10.2 准确度 本方法添加浓度 1.0 g/kg，回收率为 80120。10.3 精密度 本方法的批内变异系数 CV10，批间变异系数 CV15。DB34/T 13612011 5 AA 附 录 A（资料性附录）氯霉素标准品衍生物的选择离子质谱图 图A.1 氯霉素标准品衍生物的选择性离子质谱图 _