1、ICS 65.150 B50 DB46 海南省地方标准 DB 46/T 2802014 罗非鱼链球菌病检测技术规程 The detection technical regulations for Streptococcosis in Tilapia 2014-02-13 发布 2014-03-01 实施 海南省质量技术监督局 发 布 DB46/T 2802014 I 前 言 本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由海南省海洋与渔业厅提出并归口。本标准起草单位：海南省海洋与渔业科学院、中国水产科学研究院珠江水产研究所。本标准主要起草人：王德强、可小丽、刘志刚、佟延南、李芳远、卢
2、迈新、高风英、朱华平。DB46/T 2802014 1 罗非鱼链球菌病检测技术规程 1 范围 本标准规定了罗非鱼链球菌病病原体与流行情况、检测链球菌所用试剂、染色液和培养基、仪器设备、采样、临床诊断、实验室诊断、细菌致病性实验和结果判定等方法。本标准适用于罗非鱼链球菌病的检测与诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T
3、 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 病原体与流行情况 3.1 主要病原体 无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、海豚链球菌（Streptococcus iniae）。3.2 流行情况 在我国南方罗非鱼养殖区，一年四季均有发生，水温30以上为爆发高峰期，对各种规格罗非鱼均可造成危害。4 试剂、染色液和培养基 除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。实验中所需常规试剂、染色液和培养基均按SC/T 7201.1 和附录A的规定执行，其他分子生物学试验试剂按附录B的规定执行。5 仪器设备 除下列仪器设备外，其余仪器设备按SC/
4、T 7201.1 的规定执行。a)PCR 扩增仪。b)核酸电泳仪和水平电泳槽。c)凝胶成像仪。d)微量移液器。6 采样 DB46/T 2802014 2 病鱼样品采集按SC/T 7014的规定执行。7 临床诊断 7.1 活动情况 患病鱼活动缓慢，反应迟钝，食欲减退，离群独游；病情严重时，常在水面翻滚或打转。7.2 外部检查 体色发黑，眼球肿大突出，眼角膜发白浑浊，虹膜充血，严重者眼球脱落；下颌、鳃盖边缘、鳍条基部不同程度的充血、出血，伴有肛门红肿、外突的现象；部分急性患病个体有时无上述症状。7.3 解剖检查 肝脏充血、肿大，颜色不均，呈花肝状，质地脆弱；脾充血肿大；胆囊充盈、充满蓝黑色的胆汁；
5、部分患病鱼体出现腹水，肠道有轻度炎症，肠腔内有少量黄色的粘液。8 实验室诊断 8.1 病原菌分离 8.1.1 平板划线分离 以无菌操作分别从病鱼眼、肝脏、脾脏、肾脏和脑组织中取少量组织划线接种于血琼脂平板，28 倒置培养2448 h。8.1.2 纯培养 用无菌接种环挑取单个菌落，接种于新的血琼脂平板上，28 倒置培养24 h。8.2 菌落形态 在血平板上培养24 h后，无乳链球菌菌落圆形，直径1 mm 2 mm，呈乳白色、不透明，菌落表面湿润光滑、微隆起、边缘整齐；海豚链球菌菌落圆形，直径1.5 mm 3 mm,呈灰白色、不透明，表面光滑、湿润。8.3 革兰氏染色 按GB/T 4789.28
6、执行。无乳链球菌革兰氏染色呈阳性，菌体为球形或卵形，无鞭毛，无芽孢，菌体呈单个、成对或长链状排列。海豚链球菌革兰氏染色呈阳性，球形，单个或成对排列，少数3 4个排成短链状，无鞭毛，无芽孢。8.4 生理生化检验 8.4.1 常规检测方法 8.4.1.1 运动性试验 DB46/T 2802014 3 用灭菌牙签或接种针将纯培养的细菌穿刺垂直接种于半固体BHI培养基中央，28 培养24 h。通过细菌由中央向周边迁移形成游动圈大小来检测其运动性强弱。再用0.85%生理盐水将细菌制成轻度混浊的菌悬液（约1106 CFU/mL)，滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜观察其运动情况。8.4.1.2 生长试验 将
7、细菌接种于血平板，于10 和45 培养过夜，观察其是否生长；再将细菌分别接种于6.5%NaCl、pH 9.6的BHI液体培养基和添加0.1%美蓝牛奶BHI液体培养基中，37 孵育48 h，观察其生长情况。8.4.1.3 溶血试验 用无菌接种环将细菌接种于新鲜的的血琼脂平板上，28 倒置培养24 h。在血平板上形成明显的透明环为溶血，形成狭窄的灰绿色溶血环为溶血，不形成溶血环为溶血。8.4.1.4 马尿酸钠水解试验 用无菌接种环将待检菌接种于1 mL含1%马尿酸钠的BHI液体培养基中，37 孵育48 h，1500 g离心3min，取上清液0.8 mL，加入三氯化铁试剂0.2 mL，立即混匀，10
8、 min 15 min后观察结果；出现恒定沉淀物为阳性。8.4.1.5 接触酶试验 按SC/T 7014规定执行。8.4.1.6 淀粉水解试验 按SC/T 7014规定执行。8.4.1.7 吲哚试验 按SC/T 7014规定执行。8.4.1.8 V-P 试验 按SC/T 7014规定执行。8.4.1.9 糖类分解试验 按SC/T 7014规定执行。8.4.1.10 试剂盒检测方法 8.4.1.10.1 API 20 STREP 检测 8.4.1.10.1.1 革兰氏染色 按GB/T 4789.28 执行。8.4.1.10.1.2 接触酶试验 按8.4.1.5的规定执行。DB46/T 28020
9、14 4 8.4.1.10.1.3 溶血试验 按8.4.1.3的规定执行。8.4.1.10.1.4 生化指标检测 按API 20 STREP试剂盒说明书进行。8.4.1.10.1.5 结果判读 根据试剂盒说明书的判读表判读。8.4.1.10.2 Rapid ID 32 STREP 检测 8.4.1.10.2.1 革兰氏染色 按GB/T 4789.28 执行。8.4.1.10.2.2 接触酶试验 按8.4.1.4的规定执行。8.4.1.10.2.3 溶血试验 按8.4.1.3的规定执行。8.4.1.10.2.4 生化指标检测 按Rapid ID 32 STREP试剂盒说明书执行。8.4.1.10
10、.2.5 结果判读 用ATB TM Expression仪或mini API或人工判读。8.5 聚合酶链式反应（PCR）检测 8.5.1 细菌 16S rRNA 基因序列检测 8.5.1.1 样品处理 取细菌纯培养液2 mL 置于离心管中，12000 rpm离心10 min，收集菌体，用1 mL TE缓冲液(pH 8.0)重悬菌体；加入50 mg/mL溶菌酶溶液6L，37 水浴2 h；再加入2 mol/L NaCl 50 L，10%SDS 110 L，20 mg/mL蛋白酶K 3 L，37 水浴过夜。8.5.1.2 细菌基因组 DNA 提取 细菌DNA抽提按照SC/T 7014中8.2.7.2
11、的规定进行。8.5.1.3 PCR 扩增 16S rRNA 基因片段 8.5.1.3.1 PCR 反应体系 10 PCR buffer(含Mg2+)5 L，10 mmol/L dNTP 1 L，5 U/L Taq酶0.5 L，引物PLS和PLA(20 mol/L)各1L，DNA模板2 L，用无菌双蒸水补至50 L。8.5.1.3.2 PCR 反应程序 DB46/T 2802014 5 94 预变性5 min；94 变性 30 s，57 退火30 s，72延伸2 min，循环30次；72 再延伸10 min。8.5.1.4 电泳检测及胶回收 PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，预期扩增片段
12、大小为1471 bp。切胶回收并纯化目的条带。8.5.1.5 克隆测序 参照试剂盒说明书的操作步骤将纯化的目的片段连接于pMD18-T克隆载体，转化DH5感受态细胞，通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆进行PCR检测，并进行测序分析。8.5.1.6 测序结果分析 采用序列拼接软件ContigExpress对测序结果进行拼接，采用Vector NTI suite 8.0软件和BLAST程序(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列同源性分析。分离菌株与GeneBank中已登录的无乳链球菌或海豚链球菌16S rRNA基因序列同源性为99%以上。8.5.2 双重 PCR
13、快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌 8.5.2.1 双重 PCR 反应体系 10L 2 GC-rich buffer(含Mg2+)，dNTP 0.4 L(10mmol)，两对引物(P1和P2；P3和P4)各0.5 L(20 mol/L)，DNA模板2 L，5 U/L Ex Taq酶0.2 L，加无菌双蒸水至20 L。8.5.2.2 双重 PCR 反应程序 96 预变性5 min；94 变性45 s，51 退火30 s，72 延伸35 s，循环32次；72 再延伸10 min。8.5.2.3 电泳检测 阳性对照(模板为无乳链球菌和海豚链球菌DNA混合物)的PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果应同
14、时显474 bp和296 bp两条带，阴性对照(无DNA模板)的PCR产物电泳结果不显示任何条带，则认定检测结果成立，否则检测结果不成立。在实验结果成立条件下，若扩增产物为474 bp的唯一条带，菌株为无乳链球菌；若扩增产物为296 bp的唯一条带，菌株为海豚链球菌。9 细菌致病性实验 9.1 感染对象和条件 应选择与被检样品同龄、同规格、同品种（系）无患病史的健康罗非鱼；感染水温与原始发病水温一致。9.2 感染方式 用无菌生理盐水或蒸馏水稀释菌落，制成菌悬液，通过注射（肌肉或腹腔注射）或浸泡方式对鱼体进行人工感染，连续7 d 观察实验鱼的反应。9.3 感染结果 根据科赫法则，人工感染患病的罗
15、非鱼出现与自然患病罗非鱼相同的症状，且从人工感染患病的罗非鱼中分离出与人工感染细菌菌落形态相同的细菌，可确定为病原菌。DB46/T 2802014 6 10 结果判定 符合以下所有特征性者可判定为链球菌病：a)临床检验结果符合 7 中规定。b)菌落形态符合 8.2 的规定，革兰氏染色结果符合 8.3 规定。c)生理生化检测结果符合附录 C 中规定。d)或 API 20 STREP 或 Rapid ID 32 STREP 试剂盒的检测结果为无乳链球菌。e)或细菌 16S rRNA 基因序列同源性分析结果符合 8.5.1.6 规定。f)或双重 PCR 结果符合 8.5.2.3 规定。g)致病性实验
16、结果符合 9.3 规定。DB46/T 2802014 7 附 录 A（规范性附录）试剂的配制方法 A.1 1 TAE Buffer(pH 8.5)Tris碱242 g，Na2EDTA.H2O 37.2 g，加约800 mL去离子水，充分搅拌溶解，加入冰乙酸57.1 mL，充分搅拌后加去离子水定容至1000 mL，使用时50倍稀释。A.2 TE Buffer(Ph 8.0)：1 mol/L Tirs-HCl(pH 8.0)100 mL，0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)20 mL，混合后加去离子水定容至1 L，高温高压灭菌，室温保存。A.3 10 PCR Buffer(Mg2+Plus)：100 mmol/L KCl，160 mmol/L(NH4)2SO4，20 mmol/L MgS04，200 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，1%Triton X-100，l mg/mL BSA。A.4 BHI（脑心浸出液Brain Heart Infusion，BHI）液体培养基 A.4.1 配方 幼牛脑（提取浸出粉）200 g 牛心（提取浸出粉）250 g 葡萄糖 2 g 氯