1、 DBS 江苏省地方标准 DBS 32/0042014 食品安全地方标准 青奥会食品中致病菌快速检测 2014-06-30 发布 2014-06-30 实施 江苏省卫生和计划生育委员会 发 布 DBS 32/0042014 I 前 言 本标准系首次发布。DBS 32/0042014 1 青奥会食品中致病菌快速检测 1 范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌 O157：H7、副溶血性弧菌的病原菌自动检测系统检测方法和实时荧光 PCR 检测方法，以及志贺氏菌实时荧光PCR 检测方法。本标准适用于 2014 年青奥会食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺
2、氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌 O157：H7、副溶血性弧菌的快速检测。其他大型活动可参考本标准执行。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。第一法 病原菌自动检测系统检测 3 原理 病原菌自动检测系统利用多聚酶链反应（PCR）扩增目标细菌DNA特异片段，筛选目标菌是否存在。反应所需的引物、DNA聚合酶和单核苷酸等被合并成为一个稳定、干燥的试剂片，装入PCR反应管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR产物。PCR试剂片含有荧光染料，能结合双链DNA
3、，受光激发后能发出荧光信号。在检测过程中，病原菌自动检测系统通过测量荧光信号的变化，分析测量数据，判定阳性或阴性结果。4 设备和材料 4.1 病原菌自动检测系统。4.2 恒温空气振荡摇床：36 1、30 1。4.3 加热槽：37 1、95 1。4.4 冷却槽。4.5 天平：感量 0.1 g。4.6 均质器。4.7 冰箱：4、-20。4.8 微量移液器：1 L-10 L、10 L-100 L、100 L-1000 L。DBS 32/0042014 2 4.9 灭菌吸头：10 L、200 L、1000 L。4.10 PCR 反应管及支架。4.11 pH 计或 pH 试纸。5 试剂与培养基 5.1
4、水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格，121高压灭菌 30 min。5.2 病原菌自动检测系统检测试剂盒（溶菌试剂、试剂片）。5.3 培养基 5.3.1 7.5%氯化钠肉汤：见 GB 4789.10-2010 附录 A 中 A.2。5.3.2 缓冲蛋白胨水（BPW）：见 GB 4789.4-2010 附录 A 中 A.1。5.3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见 GB 4789.4-2010 附录 A 中 A.3。5.3.4 李氏增菌肉汤 LB（LB1，LB2）：见 GB 4789.30-2010 附录 A 中 A.3。5.3.5 改良 EC 肉汤：见 GB/T 4789.36-
5、2008 附录 A 中 A.1。5.3.6 3氯化钠碱性蛋白胨水：见 GB 4789.7-2013 附录 A 中 A.1。6 操作步骤 6.1 样品制备和增菌培养 6.1.1 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌的样品处理与增菌液按照GB 4789.10-2010中第一法5.1进行，增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36 1、200 rpm/min振摇4 h。6.1.2 沙门氏菌 沙门氏菌的样品处理与增菌液按照 GB 4789.4-2010 中 5.1 前增菌和 5.2 进行，BPW 增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36 1、200 rpm/min 振摇 2 h；移取 0.1 mL，转接种于 SC 增
6、菌液，36 1，200 rpm/min 振摇 4 h。6.1.3 单核细胞增生李斯特氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌的样品处理与增菌液按照GB 4789.30-2010中5.1进行，LB1增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，30 1、200 rpm/min振摇2 h；移取0.1 mL，转种于10 mL LB2 增菌液内，30 1，200 rpm/min振摇4 h。6.1.4 大肠埃希氏菌 O157：H7 大肠埃希氏菌O157：H7的样品处理与增菌液按照GB/T 4789.36-2008中第一法5.1进行，增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36 1、200 rpm/min振摇4 h。DBS 32/0042
7、014 3 6.1.5 副溶血性弧菌 副溶血性弧菌的样品处理与增菌液按照GB 4789.7-2013中5.1进行，增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36 1、200 rpm/min振摇4 h。6.1.6 所有剩余增菌液均存于 28，以备对阳性检测结果的确认。6.2 上机操作 6.2.1 打开加热槽分别至 37和 95。检查预冷的冷却槽（4）。开机并启动病原菌自动检测系统软件。如果仪器自检后显示“校正”，按屏幕提示进行校正操作。6.2.2 溶菌操作 将标记好的溶菌管放至管架上，在每支溶菌管加入200 L溶菌试剂。将每个增菌后的5 L样品加入相应的溶菌管中，盖上盖子。把管架放在37加热槽中20 mi
8、n。再将管架放在95的加热槽中10 min。最后将管架放在冷却槽上（冷却槽从冰箱取出后30 min内使用完毕），样品冷却5 min。6.2.3 溶菌产物转移 将PCR反应管支架放到专用冷却槽上，然后将含有试剂片的PCR反应管放入到支架内。用加样器将50 L溶菌产物加入管中，密封PCR反应管。换用新吸头，重复上述操作，直至将所有样品转入PCR反应管中。6.2.4 扩增和检测 在系统中输入标本号并在“Target”项目下选择相应的致病菌，然后点击“Apply”确定，再点击升温图标，开始预热仪器。待预热结束后，将加入溶菌产物的PCR反应管放入仪器中。运行软件至反应结束。6.3 实验结果与报告 实验结
9、束后系统会自动得出实验结果，结果报告：绿色“-”表示阴性结果；红色“+”表示阳性结果；黄色“？”表示不确定结果；黄色“？”带斜线表示错误结果。错误结果需进行重复实验至错误取消。如结果为阴性，则可按阴性结果出具报告；如结果是阳性或不确定，需按照相应国家标准进行检验（使用6.1.6中保存的增菌液进行检测，不需要重新取样），根据国家标准方法得出的结果出具报告。第二法 实时荧光 PCR 法 7 设备和材料 7.1 实时荧光 PCR 仪。7.2 冷冻离心机。7.3 均质器。7.4 恒温空气振荡摇床：36 1、30 1、41.5 1。7.5 恒温水浴锅：95 1。7.6 天平：感量 0.1 g。DBS 3
10、2/0042014 4 7.7 冰箱：4、-20。7.8 微量移液器：1 L-10 L、10 L-100 L、100 L-1000 L。7.9 灭菌吸头：10 L、200 L、1000 L。7.10 厌氧罐。7.11 灭菌 1.5 mL 离心管。8 试剂与培养基 8.1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格，121高压灭菌 30 min。8.2 Taq DNA 聚合酶：5 U/L。8.3 dNTP：10 mol/L。8.4 DNA 提取试剂：称取 0.1 g Chelex 100 粉末，加水定容至 100 mL，保存于-20备用；或使用商品化的 DNA 提取试剂盒。8.5 10 PC
11、R 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯化镁。8.6 引物和探针：引物和探针序列见附录 A。加水稀释至 10 mmol/L，其中探针的 5端标记 FAM，3端标记 TAMRA。8.7 培养基 8.7.1 7.5%氯化钠肉汤：见 GB 4789.10-2010 附录 A 中 A.2。8.7.2 缓冲蛋白胨水（BPW）：见 GB 4789.4-2010 附录 A 中 A.1。8.7.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见 GB 4789.4-2010 附录 A 中 A.3。8.7.4 李氏增菌肉汤 LB（LB1，LB2）：
12、见 GB 4789.30-2010 附录 A 中 A.3。8.7.5 改良 EC 肉汤：见 GB/T 4789.36-2008 附录 A 中 A.1。8.7.6 3氯化钠碱性蛋白胨水：见 GB 4789.7-2013 附录 A 中 A.1。8.7.7 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见 GB 4789.5-2012 附录 A 中 A.1。9 操作步骤 9.1 样品制备和增菌培养 9.1.1 金黄色葡萄球菌 操作步骤同6.1.1。9.1.2 沙门氏菌 操作步骤同6.1.2。DBS 32/0042014 5 9.1.3 单核细胞增生李斯特氏菌 操作步骤同6.1.3。9.1.4 大肠埃希氏菌 O157：
13、H7 操作步骤同6.1.4。9.1.5 副溶血性弧菌 操作步骤同6.1.5。9.1.6 志贺氏菌 志贺氏菌的样品处理与增菌液按照GB 4789.5-2012中5.1进行，增菌液置于厌氧罐，并放置于恒温空气振荡摇床中，41.5 1、200 rpm/min振摇4 h。9.1.7 增菌液密封后放置于 4冰箱保存。9.2 致病菌 DNA 提取 取9.1中培养的增菌液1 mL，加入1.5 mL无菌离心管中，8000 rpm/min离心5 min，吸弃上清；加入50 L DNA提取试剂（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5 min，12000 rpm/min，4离心5 min，取上清保存于
14、-20备用。注：也可使用商品化的细菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取致病菌DNA。9.3 实时荧光 PCR 检测 9.3.1 配置 PCR 反应体系（25 L）：10 PCR 缓冲液 2.5 L，引物各 0.5 L，探针 1 L，dNTP 1 L，Taq DNA 聚合酶 0.5 L，水 17 L，模板 DNA 2 L。9.3.2 反应条件：95预变性 30 s；94变性 5 s，60 C 退火延伸 40 s，进行 40 个循环。PCR 反应参数可根据 PCR 仪型号的不同进行适当的调整。9.3.3 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子 DNA
15、或阳性菌株 DNA，阴性对照为用水代替样品进行增菌得到的 DNA 提取液，空白对照为水。9.4 实验结果与判定 阳性对照应出现典型扩增曲线，Ct值35而40，为可疑结果。阳性结果与可疑结果须按照相应GB4789标准进行检验（使用9.1.7中保存的增菌液进行检测，不需要重新取样），根据国家标准方法得出的结果判定。DBS 32/0042014 6 A A 附 录 A（规范性附录）致病菌实时 PCR 检测所用引物和探针序列 A.1 致病菌实时荧光PCR法中所用的引物探针序列见表A.1。表A.1 致病菌实时 PCR 检测所用引物和探针序列 致病菌名称 引物序列 探针序列 副溶血性弧菌 5-GCG AC
16、C TTT CTC TGA AAT ATT AAT TGT-3 5-CGC ACA AGG CTC GAC GGC TGA-3 5-CAT TCG CGT GGC AAA CAT C-3 金黄色葡萄球菌 5-AAA TTA CAT AAA GAA CCT GCG ACA-3 5-AAT TTA ACC GTA TCA CCA TCA ATC GCT TT-3 5-GAA TGT CAT TGG TTG ACC TTT GTA-3 单核细胞增生李斯特氏菌 5-CTG AAT CTC AAG CAA AAC CTG GT-3 5-ATA CGA TAA CAT CCA CGG CTC TGG CTG G-3 5-CGC GAC CGA AGC CAA CTA-3 沙门氏菌 5-CCA GTT TAT CGT TAT TAC CAA AGG-3 5-CTC TGG ATG GTA TGC CCG GTA AAC A-3 5-ATC GCA CCG TCA AAG GTC-3 大肠埃希氏菌 O157：H7 5-TTT CAT ACT TAT TGG ATG GTC TCA A-3 5-AGG