1、ICS 67.100.10 X 04 团团 体体 标标 准准 T/BDAS 001-2021 牛奶中褪黑素含量的测定牛奶中褪黑素含量的测定 液相色谱液相色谱-串联质谱法串联质谱法 Determination of melatonin content in milk Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2021-08-11 发布 2021-09-10 实施 北京市奶业协会 发布 全国团体标准信息平台前前 言言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可
2、能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由北京首农食品集团有限公司提出，北京市奶业协会归口管理。本文件起草单位：北京首农食品集团有限公司、中国农业大学、北京三元种业科技股份有限公司、北京首农畜牧发展有限公司、北京三元食品股份有限公司、北京市奶业协会、北京奶牛中心。本文件主要起草人：刘国世、常毅、刘巧香、郭刚、马慧、陈历俊、李德勇、张红涛、廖晨星、刘林、白萨茹拉、姚松阳、刘雪凝、付瑶、王静、张伟宏、白沥冰、关盛宇、吴昊、丛慧敏。该文件为首次发布。全国团体标准信息平台牛奶中褪黑素含量的测定牛奶中褪黑素含量的测定 液相色谱液相色谱-串联质谱法串联质谱法 1 范围范围 本文件规定了牛奶
3、中褪黑素含量的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳中褪黑素的测定。本文件检测方法的检出限为 0.04 g/L，定量限为 0.10 g/L。2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 术语和定义术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理原理 牛奶中的褪黑素用甲醇提取后，用液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配外标法定量。5 试剂试剂或或材
4、料材料 5.1 试剂试剂 除非另有说明，所用试剂均为分析纯。5.1.1 水：GB/T 6682，一级。5.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.1.3 甲酸（CH2O2）：色谱纯。5.1.4 0.1%甲酸水溶液（体积比）：取 1 mL 甲酸加入至 1000 mL 水中。5.2 标准品标准品 褪黑素标准品（C13H16N2O2，CAS 号：73-31-4）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3 标准溶液配制标准溶液配制 全国团体标准信息平台5.3.1 褪黑素标准储备液：准确称取褪黑素标准品 100 mg（精确至 0.0001 g），用甲醇溶解，并定容至 100 mL 棕
5、色容量瓶中，既得 1 mg/mL 的标准储备液，于-18 中保存，有效期为1 个月。5.3.2 褪黑素标准中间液：精密移取 0.10 mL 褪黑素标准储备液于 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀既得 10 g/mL 的标准中间液。5.3.3 褪黑素标准工作液：精密移取 0.10 mL 褪黑素标准中间液于 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀既得 100 ng/mL 的标准工作液，临用现配。5.4 材料材料 一次性微孔滤膜：0.22 m，有机相。6 仪器仪器和和设备设备 6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.2 分析天平：感量 0.0001 g。
6、6.3 超声波清洗机。6.4 低温高速离心机：离心力不低于 10000 g。6.5 旋涡混合仪。6.6 移液管。7 样品样品 从所取全部样品中取出具有代表性试样约 100 mL，充分混匀，均分为两份，一份为正样，一份为备样，分别装入洁净容器中，密封，并注明标记。试样如需保存，于-18 以下冷冻保存。8 试验步骤试验步骤 8.1 试样制备试样制备 取适量有代表性的样品，液态牛奶样品直接摇匀，冷冻样品室温融化后充分均匀，置于超声波清洗机 37 超声 30 min。8.2 提取提取 准确移取 1 mL 试样置于 15 mL 离心管中，准确加入 4 mL 甲醇，使用旋涡混合仪振荡提取 10 min，-
7、18 静置 30 min。使用低温高速离心机以 10000 g、4 离心 5 min，上清液过 0.22 m 有机相滤膜过滤至样品瓶，获得试样溶液，供液相色谱-串联质谱测定。8.3 基质匹配标准工作溶液的制备基质匹配标准工作溶液的制备 8.3.1 空白样品基质的制备空白样品基质的制备 全国团体标准信息平台选取与样品属于同一类型的空白牛奶（褪黑素含量在检出限以下），按照 8.2 制备后，作为本检测法的空白基质。8.3.2 基质匹配标准上机溶液的配制基质匹配标准上机溶液的配制 用 8.3.1 制备的空白样品基质溶液配制浓度 0.01 ng/mL、0.02 ng/mL、0.05 ng/mL、0.10
8、 ng/mL 和 0.20 ng/mL 的基质匹配标准上机系列溶液。临用现制。8.4 仪器参考条件仪器参考条件 8.4.1 液相色谱参考条件液相色谱参考条件 色谱柱：C18 反相色谱柱，50 mm2.1 mm，粒径 1.8 m，或性能相当者；柱温：40；流速：0.4 mL/min；进样量：2 L；流动相及梯度洗脱结果见表 1。表 1 梯度洗脱 时间（min）0.1%甲酸水溶液（%）甲醇（%）1.00 90 10 2.00 40 60 3.50 40 60 3.60 10 90 6.60 10 90 6.70 90 10 9.00 90 10 8.4.2 质谱参考条件质谱参考条件 离子源：电喷雾
9、离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；定性离子对、定量离子对和碰撞能量的参考值见表 2，褪黑素标准溶液的定量离子色谱质谱图见附录 A。表 2 定性、定量离子对及碰撞能量的参考值 被测物名称 定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)碰撞能量(eV)褪黑素 233.1174.2 233.1174.2 10 233.1159.1 25 8.4.3 定性定性 全国团体标准信息平台在相同测定条件下，分别测定标准上机溶液（8.3.2）和试样溶液（8.2）。试样溶液中待测物质的保留时间与标准溶液中相应待测物的保留时间相对偏差不大于 2.5%，且其选择离子的相对丰度不超过表
10、3 规定时，则可判定为样品中存在对应的待测物。表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差（%）相对离子丰度/%50 2050 1020 10 允许偏差/%20 25 30 50 8.4.4 定量定量 以标准上机溶液的待测物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。该标准曲线的相关系数不低于 0.99。试样溶液中待测物的响应值应在标准曲线的线性范围内，如超出范围，应重新试验。9 试验数据处理试验数据处理 试样中褪黑素含量以质量分数 w 计，数值以微克每升（g/L）表示，按式（1）计算：=1+2110001000 （1）式中：c 由标准曲线得到的试样溶液中褪黑素质量浓度，单位为纳克每毫升，ng/mL；V1试样移取体积，单位为毫升，mL；V2提取液体积，单位为毫升，mL；测定结果用平行测定的算术平均值表示，精确到小数点后两位。10 精密度精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不超过该算术平均值的 20%。全国团体标准信息平台 附附 录录 A（资料性）（资料性）褪黑素标准褪黑素标准溶液溶液的的定量离子定量离子色谱质谱图色谱质谱图 图 A1 褪黑素标准溶液的定量离子色谱质谱图（0.1 ng/mL）全国团体标准信息平台