1、农业部953号公告一5一2007转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法1范围本标准规定了转ScGH基因促生长鲤鱼基因特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转ScGH基因促生长鲤鱼中转基因成分的定性PC检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要
2、求SC/T3016水产品抽样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1cyth基因cytb gene编码鲤鱼细胞色素b的基因。3.2ScGH基因ScGH gene大麻哈鱼生长激素基因。4原理针对转ScGH基因促生长鲤鱼含有的ScGH基因序列，设计基因特异性引物进行PCR扩增，以检测试样中是否含有ScGH基因。5试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。对实验室的要求按NY/T672执行。5.1 Taq DNA聚合酶(5U/uL)及PCR反应缓冲液（含25mmol/LMg+)。5.2DNA分子量标准：能够区分50bp1000bp的DNA片段。5.3 dNTPs混合溶液：将浓度为
3、l0mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5.4氯仿：异戊醇(24：1，/o)。5.5酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，/)。5.6琼脂糖。5.710g/L溴化乙錠溶液：称取1.0g溴化乙锭(EB),溶于100mL水中。1农业部953号公告-5一20076.4重蒸馏水发生器或超纯水仪。6.5其他分子生物学实验室仪器设备。7.操作步骤7.1抽样按GB/T18654.2和SC/T3016执行。7.2制样将待测样品（鱼肌肉、鳍条等组织）用消毒剪刀剪碎，颗粒大小在4mm以下进行DNA提取。7.3DNA模板制备7.3.1DNA模板的提取将剪碎样品30mg放人1
4、.5mL离心管中，加入300LDNA裂解液，50消化过夜，加人等体积的酚：氯仿：异戊醇溶液，震荡混匀，室温2500g离心5min,吸取上层水相，重复抽提两次。将上清液转入透析袋中进行数次透析，直到透析液OD200.05,将透析袋中的液体转入离心管中，加入无DNA的RNA酶，终浓度为100mg/L,37温浴30min。先用冰预冷的无水乙醇沉淀，4，15000g离心20mi,弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，15000g离心，2次3次，室温干燥后加TE(pH8.0)溶解，并保存于4备用。7.3.2DNA溶液纯度的测定和保存将DNA适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外分光吸收率，以一个
5、OD2so值相当于50mg/LDNA浓度来计算纯化的DNA浓度。要求DNA溶液OD2/OD2的比值在1.71.8之间。依据测得的浓度将DNA溶液稀释至25mg/L50mg/L,于一20保存。注：由于基因组DNA不宜反复冻融，建议多管分装保存，融化后应立即使用。剩余的DNA应在4冰箱中短期保存，存放时间不宜超过14d。7.4PCR反应7.4.1试样的PCR反应7.4.1.1每个试样PCR反应设置三次重复。7.4.1.2.在PCR反应管中按表1依次加人反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50L石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加)。表1PCR检测反应体系单位为微升试剂体积无菌水18.310XPCR缓冲液2.5dNTPs混合溶液125mol/L上游引物.125mol/L下游引物15U/LTaq酶0.225mg/LDNA模板1.0总体积25注：鲤鱼内标准基因PCR检测反应体系中上、下游引物分别为L和H:ScGH基因PCR检测反应体系上、下游引物分别为GH-F和GH-R。7.4.1.3将PCR管在台式离心机上离心10s后插人PCR仪中。7.4.1.4进行PCR反应。反应程序为：94变性3min;进行35次循环扩增反应(93变性30s,55(ScGH引物)或58(cytb引物)退火30s,72延伸40s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反3