1、农业部869号公告一14一2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米T25及其衍生品种定性PR方法1范围本标准规定了转基因耐除草剂玉米T25转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因耐除草剂玉米T25及其衍生品种，以及制品中T25的定性PR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及
2、其产品检测抽样NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1zSSb基因zSSIIb gene编码玉米淀粉合酶异构体zSTS-2的基因。3.2T25转化体特异性序列event-specific sequence of T25外源插入片段3端与玉米基因组的连接区序列，包括CMV35S终止子3端部分序列和玉米基因组的部分序列。4原理根据转基因耐除草剂玉米T25转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PR扩增。依据是否扩增获得预期255bp的DNA片段，检测试样中是否含有转基因耐除草剂玉米T25。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏
3、水。5.1琼脂糖。5.210g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭(EB),溶于100mL水中。注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.310mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠(NaOH)80.0g,先用160mL水溶解后，再加水定容到200mLo5.4500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0):称取18.6g乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2),加入70mL水中，再加人适量氢氧化钠溶液(5.3)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(5.3)调1农业部869号公告一14一2007按NY/T672和NY/T673规定执行。7.3试样预处理
4、按NY/T674规定执行。7.4DNA模板制备按NY/T674规定执行。7.5PCR反应7.5.1试样PCR反应7.5.1.1每个试样PCR反应设置3次重复。7.5.1.2在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50L石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加)。7.5.1.3将PCR管放人台式离心机中离心10s后插入PCR仪中。7.5.1.4运行PCR反应。反应程序为：95变性5min;进行35次循环扩增反应(94变性30s,58退火30s,72延伸30s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长)；72延伸7min。7.5.1.5反应结束后取出PCR反应管
5、，对PCR反应产物进行电泳检测。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体.积无菌水31.75L10PCR缓冲液15pL25mmol/L氯化镁溶液2.5 mmol/L5uLdNTPs0.2 mmol/L1 uL10mol/L上游引物0.5 umol/L2.5L10mol/L下游引物0.5 umol/L2.5L5u/LTag酶0.025u/lL0.25L25mg/LDNA模板1mg/12.0L总体积50L注1：如果PC缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水。注2：玉米内标准基因PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为SSIIb-F和SSIIb-R:转基因玉米T25转化体PCR检测反应体系中
6、，上、下游引物分别为T25F和T25-R。7.5.2对照PCR反应7.5.2.1在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与7.5.1相同。7.5.2.2以非转基因玉米材料中提取的DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板。7.5.2.3以转基因耐除草剂玉米T25含量为0.1%1.0%的玉米材料中提取的DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板。7.5.2.4以无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的浓度称取琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。按每100L琼脂糖溶液中加入5LEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7LPCR产物与3L3