1、DB33/T 2003DB33浙江省质量技术监督局 发布2006-01-12实施2005-12-12发布草莓脱毒种苗第1部分：脱毒种苗Virus-free plantlets of strawberryPart 1: Virus-free plantlets DB33/ 594.1-2005浙江省地方标准ICS 65.020.20B 211DB33/ 594.1-2005前 言本部分第5章为强制性条款。草莓脱毒种苗系列标准按部分发布，分为2个部分：第1部分：脱毒种苗；第2部分：生产技术规程。本部分为草莓脱毒种苗系列标准的第1部分。本部分的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本部分由浙江省农业
2、厅提出并归口。本部分起草单位： 浙江大学生物技术研究所。本部分主要起草人： 毛碧增、娄沂春、李德葆、孔樟良、吴建祥。I草莓脱毒种苗第1部分：脱毒种苗1 范围本部分规定了草莓脱毒苗的定义、分类与分级、质量要求、检验方法、检验规则和包装、标志、运输与贮存。本部分适用于通过组织培养技术培育的不携带草莓斑驳病毒（Strawberry mottle virus，SMoV）、草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）、草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）和草莓皱缩病毒（Strawberry crinkl
3、e virus，SCV）的脱毒组培瓶苗、脱毒原原种苗、脱毒原种苗及脱毒生产用苗。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 191 包装储运图示标志GB/T 2828.1-2003 计数抽样检验程序 第1部分：按接受质量限（AQL）检索的逐批检验抽样计划NY/T 401-2000 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程NY/T 406-2000 脱毒草莓种苗病毒
4、检测技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。3.1草莓脱毒苗经组织培养脱毒处理或直接引进，经检测后确认不携带本标准规定检测病毒的种苗。3.2脱毒组培瓶苗 指通过植物组织培养方法获得的不携带本标准规定检测病毒的组织培养瓶苗。3.3脱毒原原种苗指脱毒组培瓶苗移栽于无草莓病源、虫源的隔离区内成活的植株。3.4脱毒原种苗 指脱毒原原种苗定植于无草莓病源、虫源的隔离区，由第一级和第二级匍匐茎繁殖的植株。3.5脱毒生产用苗指由脱毒原种苗定植于无草莓病源、虫源的隔离区内匍匐茎繁殖的植株。3.6脱毒率指不携带本标准规定检测病毒的植株数占所检测植株总数的百分比。4 分类与分级 4.1 脱毒苗按繁育过程
5、可分为脱毒组培瓶苗、脱毒原原种苗、脱毒原种苗和脱毒生产用苗四类。4.2 脱毒组培瓶苗按质量要求分为一级、二级、三级。5 质量要求5.1 脱毒组培瓶苗质量要求脱毒组培瓶苗质量要求，见表1。表1 脱毒组培瓶苗质量要求项 目指 标一级二级三级株高，cm 6.05.04.0根茎粗，mm2.01.51.0根条数，条865根长，cm111单株复叶片数，张432病毒检测结果不携带病毒不携带病毒不携带病毒外观要求无病斑、无腐烂叶、无培养基附着5.2 脱毒种苗质量要求脱毒种苗质量要求，见表2。表2 脱毒种苗的质量要求项 目指 标脱毒原原种苗脱毒原种苗脱毒生产用苗其它主要病害发病率，% 00.51.0脱毒率，10
6、09790注：其它主要病害指危害草莓的重要真菌性病害灰霉病和白粉病。6 检验方法6.1 病毒检测方法采用指示植物小叶嫁接检测法、电镜检测法、双抗体夹心酶联免疫吸附检测法(DAS-ELISA)和分子生物学聚合酶链检测法(PCR)。在生产上只需采用指示植物小叶嫁接检测法、电镜检测法和双抗体夹心酶联免疫吸附检测法(DAS-ELISA)三种检测方法的其中一种，仲裁时采用分子生物学聚合酶链检测法(PCR)。6.1.1 指示植物小叶嫁接检测法6.1.1.1 检测病毒种类草莓斑驳病毒（SMoV）、草莓轻型黄边病毒（SMYEV）、草莓镶脉病毒(SVBV)、草莓皱缩病毒（SCV）。6.1.1.2 指示植物小叶嫁
7、接检测法具体检测方法按NY/T 406-2000附录A执行。草莓斑驳病毒（SMoV）指示植物为林丛草莓（Fragaria vesca）Alpine和UC1。弱毒株系侵染，病株叶片出现黄白色，不整齐褐色斑驳；强毒株系侵染，病株矮化，叶片变小，扭曲，呈丛簇状，叶脉透明，脉序混乱。在林丛草莓EMC上发病较重，初发冲击波状，通常是叶片卷曲，幼叶生长不对称，褪绿。弱毒株系可致数片小叶死亡，但前期仅叶柄变红，慢性症状包括弱毒株系在叶片上产生褐绿斑，叶脉轻微透明，叶片皱缩及扭曲；强毒株系导致植株生长衰退、矮化，叶片变小。草莓轻型黄边病毒（SMYEV）指示植物为林丛草莓（F. vesca）EMC，UC4，UC
8、5及深红草莓（F. vinginiana）UC 10。弱毒株系侵染，幼叶产生褐绿斑驳，叶片边缘失绿或卷曲呈杯状，植株长势衰退或矮化；强毒株系侵染，幼叶反卷，产生褐绿黄斑，成熟叶片产生坏死条斑或叶脉坏死、扭曲，致整个叶片枯死。草莓镶脉病毒(SVBV)指示植物为林丛草莓（F. vesca）Alpine 、UC6 和深红草莓（F. vinginiana）UC12，主要表现有卷叶、镶脉及坏死。卷叶症状为小叶向背面反卷，植株矮化。镶脉症状为发病初期病叶沿主脉及次脉产生褪绿条斑，之后形成黄色条斑。坏死症状为发生在成熟叶片上，网脉变黑或坏死，脉间组织褪绿或坏死，后期部分或全部枯死。草莓皱缩病毒（SCV）指示
9、植物为林丛草莓（F. vesca）UC1、UC4、UC5、UC6、Alpine和深红草莓（F. vinginiana）M1、UC10、UC11和UC12，主要表现为叶片上产生褪绿斑，叶片大小不等，扭曲变形，叶柄上产生褐色或黑色坏死斑，在花瓣上产生暗条纹或黑色坏死条斑。6.1.2 电镜检测法6.1.2.1 检测病毒种类草莓斑驳病毒（SMoV）、草莓轻型黄边病毒（SMYEV）、草莓镶脉病毒(SVBV)和草莓皱缩病毒（SCV）。6.1.2.2 检测程序病毒粒子电镜观察，采用叶浸蘸负染法，研磨，组织汁液经2%的磷钨酸负染。细胞病理组织超薄切片法观察，叶片切成1 mm22 mm2小块，以2.5%戊二醛及
10、4%四氧化锇固定，系列脱水，包埋，超薄切片，以2%醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，电镜观察。草莓斑驳病毒（SMoV）为未归属病毒，是球状病毒颗粒，直径为25 nm 30 nm，在叶片的表皮和韧皮部的细胞质内有晶状球形颗粒。草莓轻型黄边病毒（SMYEV）属马铃薯X病毒属（Potexvirus），为线状病毒颗粒，14 nm500 nm，分布在细胞质内。草莓皱缩病毒（SCV）属弹状病毒科（Rhabdoviridae）的细胞质弹状病毒属（Cytorhabdovirus）,为弹状病毒颗粒。在植物组织中，成熟病毒颗粒直径为63 nm75 nm，粒体长度为190 nm380 nm，在植株表皮、导管和筛管附近的
11、薄壁组织细胞内均有分布。草莓镶脉病毒(SVBV)属花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）的花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)，为球形病毒颗粒，直径40 nm50 nm。主要在细胞质内复制，存在于叶片表皮与木质部相连的导管和细胞质内。6.1.3 双抗体夹心酶联免疫吸附检测法(DAS-ELISA)用于检测草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒。检测方法按NY/T401-2000中附录A的方法执行。6.1.4 分子生物学聚合酶链检测法(PCR) 6.1.4.1 草莓斑驳病毒（SMoV）草莓斑驳病毒（SMoV）是RNA病毒。取各编号株的叶片，提取总RNA，反转录为cDNA后进行PCR检测。
12、利用引物（上游引物5TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG3和下游引物5TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG3）扩增得到219 bp的片段。6.1.4.2 草莓轻型黄边病毒（SMYEV）草莓轻型黄边病毒（SMYEV）是一种单链线形正义RNA病毒。取各编号株的叶片，提取总RNA，反转录为cDNA后进行PCR检测。利用引物（上游引物5GTGTGCTCAATCCAGCCAG3和下游引物5CATGGCACTCATTGGAGCTGGG3）扩增得到271 bp的片段。6.1.4.3 草莓镶脉病毒(SVBV)草莓镶脉病毒(SVBV)是一种DNA病毒。取各编号植株的叶片，提取基因组DNA，
13、进行PCR检测。利用引物（上游引物5GAATGGGACAATGAAATGAG3和下游引物5GTGAGGAGAACTTAGGACA3）扩增得到600 bp的片段。6.1.4.4 草莓皱缩病毒（SCV）草莓皱缩病毒（SCV）是单链线形负义ssRNA病毒。取各编号株的叶片，提取总RNA，反转录为cDNA后进行PCR检测。利用引物（上游引物5CATTGGTGGCAGACCCATCA3和下游引物5TTCAGGACCTATTTGATGACA3）扩增得到345 bp的片段。6.2 其它项目检验方法6.2.1 精确度达0.1毫米的长度计量器具测定株高、根茎粗和根长。6.2.2 根数、单株复叶叶片数、灰霉病和白
14、粉病的主要发病症状，用目测法。7 检验规则7.1 组批同一时间，同一地点，取得同一品种不同单株的外植体经过组织培养培育的脱毒苗为同一组批。7.2 出厂（圃）检验和型式检验7.2.1 出厂（圃）检验 由厂家执行检验组培瓶苗和脱毒种苗的株高、根茎粗、根条数、根长、单株复叶叶片数。并附有草莓脱毒苗出厂（圃）合格证（见附录A）。7.2.2 型式检验 型式检验的项目为本标准第5章中所规定的所有项目（见附录B和附录C）。在正常生产时，每年进行一次。新建厂家和改变工艺程序时也应进行型式检验。7.3 抽样方案7.3.1 抽样时间种苗在繁殖圃内生长成苗（6片叶以上）后抽取。7.3.2 检验水平特殊检验水平S-4。7.4 判定规则采用GB/T 2828.1-2003的正常检验二次抽样方案。在检验中，本标准采用接受质量限（AQL）值见表3。当检验批不满足接受质量限（AQL）时，判该批产品不合格。表3 接受质量限（AQL）值项目接受质量限（AQL）脱毒瓶苗脱毒原原种脱毒原种脱毒生产用苗病毒检测0.40.651.01.5其他主要病害0.40.651.01.5株高1.51.52.54.0根茎粗根条数根长单株复叶叶片数注：其它主要病