1、I C S 6 5.0 2 0.3 0B 4 4臀鹭中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 4 9 2 6G B/T 1 4 9 2 6G B/T 1 4 9 2 6G B/T 1 4 9 2 6.1 一1 4 9 2 6.6-2 0 0 1.8-1 4 9 2 6-1 7-2 0 0 1.4 1-2 0 0 1.4 4 一 1 4 9 2 6.4 9-2 0 0 1实验动物微生物学检测方法(2)L a b o r a t o r y a n i m a l-Mi c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n m e t h
2、o d s2 0 0 1 一 0 8 一 2 9 发布2 0 0 2 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布食品伙伴网http:/ 11n几八八八乃八JA占八峪叹UL门:Jhh户匕门了月了口U只QG B/T 1 4 9 2 6.1-2 0 0 1 实验动物沙门菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.2-2 0 0 1 实验动物单核细胞增生性李斯特杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.3-2 0 0 1 实验动物 耶尔 森菌检 测方法G B/T 1 4 9 2 6.4-2 0 0 1 实验动物皮肤病原真菌检测方法 G B/T 1 4
3、 9 2 6.5-2 0 0 1 实验动物多杀巴斯德杆菌检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.6-2 0 0 1 实验动物支气管鲍特杆菌检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.8-2 0 0 1 实验动物支原体检测方法 。GB/T 1 4 9 2 6.9-2 0 0 1 实验动物鼠棒状杆菌检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.1 0-2 0 0 1 实验动物泰泽病原体检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 1-2 0 0 1 实验动物大肠埃希菌。1 1 5 a,c:K(B)检测方法 G B/T 1 4 9 2 6.1 2-2 0 0 1 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌检测方法G B/T
4、 1 4 9 2 6.1 3-2 0 0 1 实验动物肺炎克雷伯杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 4-2 0 0 1 实 验动物 金黄色葡萄球菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 5-2 0 0 1 实 验动物 肺炎链球菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 6-2 0 0 1 实验动物乙型溶血性链球菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.1 7-2 0 0 1 实验动物绿脓杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 1-2 0 0 1 实验动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 4-2 0 0 1 实验动物念珠状链杆菌检测
5、方法G B/T 1 4 9 2 6.4 5-2 0 0 1 实验动物布鲁杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 6-2 0 0 1 实验动物钩端螺旋体检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 7-2 0 0 1 实验动物志贺菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 8-2 0 0 1 实验动物结核分枝杆菌检测方法G B/T 1 4 9 2 6.4 9-2 0 0 1 实验动物空肠弯曲杆菌检测方法食品伙伴网http:/ s/T 1 4 9 2 6-4 6-2 0 0 1前言本标准规定了犬型钩端螺旋体的检测方法。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物
6、学会。本标准主要起草人:范薇。食品伙伴网http:/ 华 人 民 共 和 国 国 家 标准实验动物钩端螺旋体检测方法GB/T 1 4 9 2 6.4 6-2 0 0 1L a b o r a t o r y a n i m a l-Me t h o d f o r e x a mi n a t i o n o f L e p t o s p i r a s p.范围本标准规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法。本标准适用 于犬型钩端螺旋体 的检测。2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使
7、用下列标准最新版本的可能性。G B/T 1 4 9 2 6.4 2-2 0 0 1 实验动物 细菌学检测 标本采 集 G B/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 实验动物 细菌学检测染色法、培养基和试剂 G B/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1 实验动物酶联免疫吸附试验原理 钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合，产生凝集反应和形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。主要设备和材料普通恒温培养箱。实体显微镜。恒温水浴箱。
8、高速离心机。超声波细胞粉碎器。酶标仪。微量加样器，容量 5 5 0 I L和 5 0-2 0 0 W L,培养基及试荆441424.3444.5464.75犬型钩端螺旋体标准抗原标准阳性血清。标准阴性血清生理盐水。ELI S A抗原 钩端螺旋体培养月.口乙0口J亡J工J JJJ二J二JJ中华人民共和国国家质，监督检验检疫总局 2 0 0 1 一 0 8-2 9 批准2 0 0 2一 0 5 一 0 1实施食品伙伴网http:/ 1 4 9 2 6-4 6-2 0 0 1 各群钩端螺旋体标准株接种 K o r t h o f 培养基，2 8 C培养 5-7 d,5.5.2 生长良好的培养物用 1
9、 0 0 0 0 r/m i n离心 3 0 mi n，沉淀用 P B S在相同条件下洗 2 次。5.5.3 上述沉淀用 P B S悬浮，超声波打碎后，1 0 0 0 0 r/m i n离心 2 0 min，上清即为 E L I S A抗原。5.6 酶结合物 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬 馆G抗体，辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(S P A)5.7 阳性血清 钩端螺旋体免疫S P F犬所获得的血清，或自然感染后所获得的血清。5.8 阴性血清 无钩端螺旋体感染犬血清。5.9 其他试剂溶液的配制见G B/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1,检测方 法6.1 试管凝集实验6.1 门检测
10、 程序6.1.2 操作步骤6.1.2.1采样 采血、分离血清。6 门.2.2 血清稀释 参照表 1 进行。将待检血清以5 6 水浴灭活 3 0 mi n后备用。取 9 6 孔板，第 1 孔加人生理盐水 0.1 6 m L，以后每孔加人生理盐水 0.1 mL，一直加到第 9 孔。在第 1 孔中加人血清 0.0 4 m L,混匀后，吸取 0.1 mL到第 2孔，如此类推，直到第 9 孔，弃去。.1 M L.食品伙伴网http:/ B/T 1 4 9 2 6.4 6-2 0 0 16，.2.3 对照 另标明 1 0,1 1,1 2孔，第 1 0 孔加人阴性血清。.1 ml，第 1 1 孔加人阳性血清
11、0.1 mL，第 1 2 孔加人生理盐水。1 mL,6.1.2.4 加人抗原 将各孔加人标准抗原 0.1 m L,混匀，此时各孔血清稀释度为 1，1 0,1，2 0,1，4 0,1，8 0,1，1 6 0,1:3 2 0,1:6 4 0,1:1 2 8 0,1:2 5 6 0。具体操作见表1。置3 7 C 温箱 2 h，取出后摇匀，用接种环挑取各孔中的反应物置于载玻片上，在暗视野下观察结果。表 1 钩端螺旋体定量显凝试验操作方法6.12.5 结果判定 +:几乎全部钩端螺旋体呈鳅鲜状或折光率高的团块，或有大小不等的点状或块状残片，仅 有少数游离的钩端螺旋体。十+:7 5%的钩端螺旋体被凝集，大部
12、分呈块状或蜘蛛状，尚有 2 5%菌体游离。+:5 0%左右的钩端螺旋体被凝集，尚有 5 0 0 o 菌体游离。+:2 5%左右的钩端螺旋体被凝集，尚有 7 5 0 o 菌体游离。一:全部菌体正常，分散，无凝集块，菌数与对照相同。待检血清凝集效价在 1:2 0 达到“+”或以上时，均判为阳性反应。6.2 酶联免疫吸附试验(E L I S A)6.2.1 包被抗原 根据滴定的 最适工 作浓度，将抗原用包被液稀释。每孔1 0 0 I L,置3 7 C 1 h 后再4 过夜。6.2.2 用洗涤液洗 5 次，每次 3 mi n，叩千。6.2.3加样 待检血清和阴 性、阳 性血清分别用稀释液做1:4 0
13、稀释，每 孔1 0 0 1,L,3 7 0C 1 h，洗涤同上。6.2.4 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔加人1 0 0 p L,3 7 C 1 h，洗涤同 上。6.2.5 加底物溶液 每孔加人新配制的 底物溶液1 0 0 I L，置3 7 C,避光显色1 0.1 5 m i n,6.2.6 终止反 应 每孔加人终止液5 0 匹。6.2.7 测 A值 在酶标仪上，于4 9 0 n m处读出各孔A值6.2.8 结果判定 在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。6.2-8.1 同时符合下列 2 个条件者，判为阳性。a.待检血清的A值)0.2;b.待检血清的A值/阴性对照血清的A值)2.1 e6.2.8.2 均不符合上述 2 个条件者，判为阴性。食品伙伴网http:/ s/T 1 4 9 2 6.4 6-2 0 0 16.2.8.3 仅有 1 条符合者，判为可疑，需重试。如为阳性则判为阳性。6.2-8.4 对阳性结果需重试，如再为阳性则判为阳性。7结果报告凡符合上述各项 检测结果者作出 阳性报告，不符合者作 出阴性报告。食品伙伴网http:/