1、ICS 65.020 B16 DB35 福建省地方标准 DB 35/T 12182011 马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程 Technical standard for identification on the physiological races of phytophthora infestans on potato 2011-12-31 发布 2012-03-15 实施福建省质量技术监督局 发 布 DB35/T 12182011 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 术语和定义.1 3 接种体的制备.1 3.1 培养基的配制.2 3.1.1 黑麦培养基.2 3.1.2 选择性培养
2、基.2 3.1.3 MS 培养基.2 3.2 晚疫病样的采集.2 3.3 晚疫病菌的分离.2 3.3.1 保湿培养分离法.2 3.3.2 薯片夹叶分离法.2 3.4 晚疫病菌的鉴定与纯化.2 3.5 晚疫病菌的保存.2 3.6 孢子囊悬浮液的制备.2 4 鉴别寄主的保存与扩繁.3 4.1 保存.3 4.2 扩繁.3 5 接种鉴定.3 5.1 接种方法.3 5.2 接种技术.3 5.3 接种后的培养.3 6 病情调查.3 6.1 调查时间.3 6.2 病情调查方法.3 7 生理小种确定.3 8 鉴定后材料的灭活处理.4 附录 A（资料性附录）致病疫霉菌菌落培养特征及孢子囊形态特征.5 附录 B（
3、规范性附录）植物水培标准营养液配方.6 附录 C（规范性附录）马铃薯晚疫病菌生理小种命名方法.7 DB35/T 12182011 II 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则进行编写 本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：李本金、陈庆河、翁启勇、兰成忠、赵健、邱荣洲。DB35/T 12182011 1 马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程 1 范围 本规程规定了马铃薯晚疫病菌生理小种室内鉴定的接种体的准备、鉴别寄主的保存与扩繁、接种鉴定、病情调查、生
4、理小种确定、鉴定材料的灭活处理的方法。本规程适用于马铃薯晚疫病菌生理小种的室内鉴定。2 术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。2.1 人工接种鉴定 Artifical inoculation 在人工控制的条件下，用马铃薯晚疫病菌孢子囊接种到马铃薯鉴别寄主的离体叶片上，根据接种叶片的孢子囊产生状况确定菌株所属的具体生理小种。2.2 接种体 Inoculant 用于人工接种鉴定用的马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)孢子囊悬浮液。2.3 离体叶片接种法 Leaf inoculate in vitro 用鉴别寄主植株中部复叶的小叶片接种的方法。2.4 对照品种 Contr
5、ast cultivar 不含已知抗病基因的马铃薯感病品种（r）。2.5 鉴别寄主 Differentiate host 一套含有（R1R11）主效抗性单基因和对照的马铃薯品种。3 接种体的制备 DB35/T 12182011 2 3.1 培养基的配制 3.1.1 黑麦培养基 将黑麦50 g加适量去离子水浸泡36 h，匀浆机捣碎，5560水浴1 h2 h，四层纱布过滤，上清液补水至1000 mL，加入琼脂17 g，121高压灭菌25min。3.1.2 选择性培养基 在黑麦培养基中加入利福平20mgL-1，氨卞青霉素200mgL-1，70%五氯硝基苯100mgL-1。3.1.3 MS 培养基 硝
6、酸铵(NH4NO3)1.65g，硝酸钾(KNO3)1.9g，氯化钙(CaCl2.2H2O)0.44g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.37g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.17g，碘化钾(KI)0.83mg，硼酸（H3BO3）6.2 mg，硫酸锰(MnSO4.4H20)22.3 mg，硫酸锌(ZnSO4.7H20)8.6 mg，钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)0.25 mg，硫酸铜(CuSO4.5H20)0.025 mg，氯化钴(CoCl2.6H20)0.025 mg，硫酸铁(FeSO4.7H20)27.8 mg，乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA.2H20)37.3 mg，肌醇100.0
7、 mg，烟酸0.5 mg，盐酸吡哆醇0.5 mg，盐酸硫胺素0.5 mg，甘氨酸2.0 mg，蔗糖30 g，琼脂7 g，蒸馏水加至1000 mL，消毒前调至pH 5.8。3.2 晚疫病样的采集 在晚疫病发生或流行时期，采集具有典型症状的马铃薯晚疫病病叶，用保鲜袋或薯片夹叶带回实验室，贮放在1820光照培养箱中备用。3.3 晚疫病菌的分离 3.3.1 保湿培养分离法 将采回的病叶用自来水冲洗干净，凉干后，叶背朝上放入培养皿内，1820培养箱内保湿培养1d2d。挑取霉层置于选择性培养基上，1820培养7d9d(菌落直径长至2cm3cm)，备用。3.3.2 薯片夹叶分离法 取无可见症状的感病品种薯块
8、清洗干净，晾干，用75%的乙醇溶液浸泡30s40s，取出，烧干表面残存的乙醇。将薯块切成约5mm厚的薯片，放在已灭菌的培养皿中。取用薯片夹病叶法采集的一小块病叶组织置于已消毒的两薯片之间，在1820培养，待薯片长出霉层后，直接挑取霉层置于选择性培养基上，1820培养7d9d(菌落直径长至2cm3cm)，备用。3.4 晚疫病菌的鉴定与纯化 挑取3.3分离的少量菌丝制成玻片，在100倍显微下观察菌体形态。当菌体形态与附录A相符时，则确定所分离的病菌为致病疫霉菌。挑取致病疫霉菌的菌落边缘的单菌丝段，置于选择性培养基上，按3.3.1的培养条件进行培养。3.5 晚疫病菌的保存 纯化的晚疫病菌株转移到黑麦
9、培养基培养，当培养基斜面上长满菌丝后，灌注灭菌过的液体石蜡密封，置于13黑暗中保存。3.6 孢子囊悬浮液的制备 DB35/T 12182011 3 将不携带抗病主效基因的新鲜马铃薯薯块按3.3.2的方法进行消毒。将在黑麦培养基上培养7d10d的马铃薯晚疫病菌菌种接种在消毒薯片上，按3.3.2的方法进行培养。待薯片表面长满白色菌丝及孢子囊时，刮取薯片上的菌体放入装有3mL灭菌水的离心管中，振荡后配成孢子囊悬浮液，用 2层纱布过滤收集孢子囊悬液。用血球计数板将孢子悬浮液的终浓度调配至每毫升约含5104个孢子囊，置于4冰箱内处理2h3h诱导游动孢子释放，获取游动孢子悬液备用。游动孢子悬浮液应在使用当
10、天制备。4 鉴别寄主的保存与扩繁 4.1 保存 鉴别寄主均应以脱毒试管苗进行保存，在无菌条件下，用MS培养基继代培养鉴别寄主。4.2 扩繁 将移植15d20d后的鉴别寄主试管苗扦插于以珍珠岩为基质的容器中，用植物水培营养液（见附录B）浇施，生长期温度控制在2023之间。约30d后采摘植株中部同叶龄健康复叶进行接种。5 接种鉴定 5.1 接种方法 采用离体叶片接种法。5.2 接种技术 在直径为9cm的培养皿中倒入灭菌后融化的1.5%水琼脂培养基30mL，待培养基凝固后，取鉴别寄主植株复叶的小叶片，背面朝上按编号摆放在培养皿内，用微量移液器吸取20 L3.6配制的游动孢子悬浮液，接种在每个小叶背面
11、近中脉两侧。每个菌株设置3次重复，并以无菌水处理为对照。5.3 接种后的培养 将5.2接种后的叶片经17黑暗培养1d，将叶片翻转过来，在1718的光照培养箱中按光：暗=16：8保湿培养。6 病情调查 6.1 调查时间 接种57d后观察并记录病情。6.2 病情调查方法 用放大15倍的体视镜检查接种部位孢子囊的产生情况，当产生孢子囊的叶片判定为感病型，无产生孢子囊的叶片判定为抗病型。各处理的每个重复的叶片有3/4或以上为感病型，则该菌株对该寄主有毒力。若同一处理的3个重复的结果不一致视为无效处理。7 生理小种确定 DB35/T 12182011 4 根据供试菌株在以上鉴别寄主的抗（感）病型确定所属
12、生理小种。各生理小种在鉴别寄主上的抗感病型模式见附录C 8 鉴定后材料的灭活处理 将接种后剩余的接种体、接种鉴定后的植株残留物等集中到容器中经121、20min灭活处理。DB35/T 12182011 5 A A 附 录 A（资料性附录）致病疫霉菌菌落培养特征及孢子囊形态特征 致病疫霉菌菌落为白色棉絮状（见图 A1）。菌丝为无色、无隔膜。孢囊梗无色，具 3-4 分枝，在产生每个孢子囊的部位，孢囊梗膨大成节状，节基部钝圆而顶端尖细。孢子囊单胞无色，卵圆形，顶端有乳状突起（见图 A2）。图A.1 致病疫霉菌菌落形态 图A.2 致病疫霉菌孢子囊形态 DB35/T 12182011 6 B B 附 录
13、 B（规范性附录）植物水培标准营养液配方 营养液配方：尿素g、氯化钙(CaCl2.2H2O)0.56g、磷酸二氢钾(KH2PO4)3.0g、硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g、硫酸锌(ZnSO4.7H20)1.0mg、硫酸铁(FeSO4.7H20)3.0mg、硫酸铜(CuSO4.5H20)1.0mg、硫酸锰(MnSO4.4H20)3.0mg、硼酸粉（H3BO3）2.0mg，加纯净水 10 升，充分溶解后即成营养液。配制营养液的注意事项：配制营养液用玻璃、搪瓷、陶瓷等容器，切忌用金属容器。在配制时，应先用5060的少量纯净水分别溶化各种元素后，再倒入水中，边倒边搅拌，充分混合。调整营养液和酸
14、碱度：纯净水用试纸测定为碱性时，应用磷酸来中和。如强酸性时，则滴加氢氧化钠中和，使之呈中性或微酸性。DB35/T 12182011 7 C C 附 录 C（规范性附录）马铃薯晚疫病菌生理小种命名方法 根据各供试菌株在 11 个含单基因（抗性基因）上的表现症状来进行马铃薯晚疫病病菌生理小种的命名，所有的生理小种均能侵染不具任何抗性基因的品种（r）,如生理小种 1.2.3.4，则表明该生理小种除了能侵染不具任何抗性基因的品种（r）外，还可侵染 R1、R2、R3 和 R4，并表现出发病症状，而对R5、R6、R7、R8、R9、R10 和 R11 均不能侵染，不能表现发病症状；如生理小种 3.7.8.10.11，则表明该生理小种除了能侵染不具任何抗性基因的品种（r）外，还可侵染 R3、R7、R8、R10 和 R11，并表现出发病症状，而对 R1、R2、R4、R5、R6、和 R9 均不能侵染，不能表现发病症状；依此类推，进行马铃薯晚疫病病菌生理小种鉴定。_