1、I C S1 1 2 2 0B4 1圆目中华人民共$-n 国国家标准G B T2 7 5 1 7 2 0 1 1鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合R T P C R 方法Am u l t i p l e xR T _ P C Rm e t h o dt od i f f e r e n t i a t et h eh i g h l yp a t h o g e n i ca n dc l a s s i c a lp o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r
2、u s2 0 1 1-1 1 2 1 发布2 0 1 2-0 3-0 1 实施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“刖昌G B T2 7 5 1 7 2 0 本标准按照G B T1 12 0 0 9 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(s A c T c1 8 1)归口。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：吴志明、闫若潜、张志凌、张健、荆汝顶、刘光辉、赵明军、曹杰伟、钱勇、程俊贞、赵雪丽、张盼。1 范围鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合R T P C R 方法G B T2 7 5 1 7 2
3、0 1 1本标准规定了检测以基因组非结构蛋白N s p 2 编码区缺失3 0 个氨基酸为特征的猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株与非缺失3 0 个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株复合R T P C R 鉴别诊断方法。本标准适用于疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V)感染猪血清及临床病料等样品中的病毒核酸检测。2 试剂和仪器设备除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取R N A 所用试剂均应使用无R N A 酶的容器进行分装。2 1 试剂2 1 1 拭子悬液(见附录A)，组织悬液(见附录A)，以上试剂常温保存。2 1 2 阿氏液(见附录A)，裂解液(T r i z 0 1)，1
4、 T A E 核酸电泳缓冲液(见附录A)，氯仿，0 O lm o l L(p H 7 2)的P B S(见附录A)，D E P C 处理水(见附录A)，以上试剂4 保存。2 1 3 异丙醇，7 5 乙醇，D N A 分子量标准，6 电泳上样缓冲液，以上试剂一2 0 保存。2 1 4 阳性对照、阴性对照(见附录A)。2 1 5 复合R T-P C R 扩增用上、下游引物序列参见附录B。2 1 6 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合R T P C R 反应体系组成、说明及使用注意事项参见附录c。2 2 仪器设备P C R 扩增仪，高速冷冻离心机(离心力在1 20 0 0 9 以上)，
5、核酸电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，2 8 冰箱，-2 0 冰箱，单道微量移液器(o 5 弘L 1 0p L；2p L 2 0p L；2 0 肛L 2 0 0p L；1 0 0p L 10 0 0p L)，组织匀浆器或研钵，凝胶成像系统(或紫外透射仪)，真空干燥器(非必备)。3 样品的采集、处理、存放及运输3 1样品采集及处理过程的注意事项采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子。3 2 样品的采集及处理3 2 1 拭子样品3 2 1 1 鼻腔拭子：采样时要将棉拭子深入鼻腔来回刮3 5 次，取鼻腔分泌物。G B T2 7 5 1 7 2 0 1 13 2 1
6、2 肛门拭子：将棉拭子深入肛门转一圈沾取粪便。3 2 1 3 将鼻腔拭子和肛门拭子一起放入盛有1 0m L 拭子悬液的E p p e n d o r f 管中，然后将拭子悬液转入无菌E p p e n d o r f 管中，4 条件下50 0 0r m i n 离一t 71 0m i n，取上清转入新的无菌E p p e n d o r f 管中，编号备用。3 2 2 组织样品组织样品采集时应采取有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏、胸腺等组织样品。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品0 5g 左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加0 3m L O 5m LP B S 混匀，然后将组织
7、悬液转人无菌E p p e n d o r f 管中，4 条件下50 0 0r r a i n 离心1 0m i n，取上清转入新的无菌E p p e n d o r f 管中，编号备用。3 2 3 血清或抗凝血用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3m L 5m L，待血清析出后直接吸取至无菌E p p e n d o r f 管中，编号备用；用无菌注射器先吸人抗凝剂(阿氏液)2m L 3m L，再自耳静脉或前腔静脉采集等量血液，快速混匀后转入无菌E p p e n d o r f 管中，编号备用。3 3 存放与运送采集或处理的样品在2 8 条件下保存应不超过2 4h；若需长期保存，应放置一
8、7 0 冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。4 操作方法4 1 样品R N A 的制备4 1 1 取1 5m L 灭菌E p p e n d o r f 管，每管加入3 0 0p L 裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各1 0 0 L L，吸头反复吸打混匀(一份样品换用一个吸头)；再加入1 0 0p L 氯仿，充分颠倒混匀(不宜过于强烈)；于4 条件下，1 20 0 0r m i n 离心1 5m i n。4 1 2 吸取离心后各管中的上清液1 5 0p L 转移至新的1 5m L 灭菌E p p e n d o r f
9、 管中(注意不要吸出中间层)，加入1 5 0p L-2 0 预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置1 5m i n。4 1 34 条件下1 20 0 0r m i n 离心1 5r n i n(E p p e n d o r f 管开口保持朝离一t 7 机转轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应置于吸水纸不同地方沾干。加入1m L7 5 乙醇，轻轻颠倒洗涤。4 1 44 条件下1 20 0 0r r a i n 离一t 75m i n(E p p e n d o r f 管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸
10、干。4 1 54 条件下1 20 0 0r m i n 离心3 0s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，真空抽干3m i n5m i n 或室温干燥1 0m i n。不宜过于干燥，以免R N A 不易溶解。4 1 6 加入1 1p LD E P C 处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的R N A，20 0 0r m i n 离心5s，冰上保存备用。提取的R N A 应在2h 内进行R T-P C R 扩增或放置于一7 0 冰箱备用。4 2反转录(c D N A 的合成)配制反转录反应体系(参见附录c)，向每管中加入4 1 6 中相应
11、R N A1 0p L，3 7 水浴1h 或置于P C R 仪中3 7 1h，反应结束后，7 0 1 5m i n 灭活反转录酶，直接用于下面的P C R 扩增或一2 0 冻存备用。24 3 复合P C R 扩增G B T2 7 5 1 7 2 0 11配制复合P C R 反应体系(参见附录c)，在室温下融化后，瞬时离心使液体全部聚集在管底部，向每管中加入4 2 中相应c D N A4p L，经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底，加入2 5“L 的石蜡油覆盖液面(若P C R 仪具有热盖加热功能时P C R 反应管中也可不加石蜡油，但推荐采用加石蜡油的方法)。P C R 扩增条件：9 5
12、预变性5m i n 后，9 4 4 5S，5 9 4 5s，7 2 4 5S 共3 5 个循环，最后7 2 延伸1 0r a i n。扩增反应结束后取出放置于4。4 4P C R 扩增产物的电泳检测称取1 2g 琼脂糖加入1 0 0m L 核酸电泳缓冲液中加热，充分溶化后稍放凉，加入适量的溴化乙锭(终浓度0 5p g m L)，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入1 T A E 核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5$z L 1 0v LP C R 扩增产物分别和1p L 2p L6 电泳上样缓冲液混合后，分别加样到各凝胶孔，取5p LD N A 分手量标准加到一凝胶孔中。5V c m 恒压下
13、电泳3 0r a i n 左右。将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录。5 结果判定5 1 试验结果成立条件猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株阳性对照的P C R 扩增产物，经电泳后分别在4 0 0b p和2 6 4b p 位置出现特异性条带，同时阴性对照的P C R 扩增产物电泳后没有任何条带(参见附录D)，则试验结果成立；否则结果不成立。5 2 阳性判定在试验结果成立的前提下，如果样品的P C R 产物电泳后在4 0 0b p 和2 6 4b p 的位置上同时出现特异性条带，判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株核酸检测双阳性；若4 0
14、0b p 位置出现特异条带而2 6 4b p 位置无特异条带，判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株核酸检测阳性；若2 6 4b p 位置出现特异条带而4 0 0b p 位置无特异条带，判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株核酸检测阳性。5 3 阴性判定在试验结果成立的前提下，如果4 0 0b p 和2 6 4b p 位置均未出现特异性条带，判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株核酸检测阴性。G B T2 7 5 1 7 2 0 11A 1 拭子悬液附录A(规范性附录)试剂的配制在0 0 1m o l LP B S 液中添加以上所有的抗生素，浓度提高5 倍；加入抗生素后调p H 值至7
15、 2 7 4。A 2 组织悬液在0 0 1m o l LP B S 液中添加青霉素(20 0 0I u m L)，链霉素(2m g m L)、庆大霉素(5 0p g m L)和制霉菌素(10 0 0I U m L)。A 3 阿氏液葡萄糖2 0 5g，柠檬酸钠0 8g，柠檬酸0 0 5 5g，氯化钠0 4 2g，加蒸馏水至1 0 0m L，溶解后调p H 值至6 1，6 9k P a1 5r a i n 高压灭菌，4 保存备用。A 41 T A E 核酸电泳缓冲液T r i s 碱，2 4 2g；冰乙酸，5 7 1 m L；o 5 m o l L E D T A(p H 8 0)，1 0 m L
16、；加蒸馏水至1 0 0 m L，使用时用蒸馏水作5 0 倍稀释，即为l T A E 核酸电泳缓冲液。A 50 0 1m o l L(p H 7 2)的磷酸盐缓冲液(P B S)A 5 1A 液(o 2m o l L 磷酸二氢钠水溶液)：N a H：P O。H。O2 7 6g，先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至10 0 0m L。A 5 2B 液(o 2m o l L 磷酸氢二钠水溶液)：N a：H P 0 4 7 H 2 05 3 6g，(或N a 2 H P 0 4 1 2 H 2 07 1 6g 或N a z H P O t 2 H z O3 5 6g)先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至l0 0 0m L。A 5 30 0 1m o l LP B S 的配制：A 液1 4m L，B 液3 6m L，加氯化钠(N a C I)8 5g，最后用蒸馏水稀释至10 0 0m L；1 2 1，1 5m i n 高压灭菌，4 保存备用。A 6D E P C 处理水用0 1 D E P C 处理后的蒸馏水，经1 2 1 1 5m i n 高压处理，用于溶解R N A。A 7 阳性对照经M