1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 3 5 4-2 0 0 4进出口蜂蜜中咖啡因含量检验 方法液相色谱法D e t e r mi n a t i o n o f c a f f e i n e i n h o n e y f o r i m p o r t a n d e x p o r t-L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1实施中华人民共和国国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 3 5 4-2 0 0 4月U吕本标准的附录A为资料性附录
2、。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。本标准由中华人民共和国湖南出人境检验检疫局负责起草.本标准主要起草人:戴华、李拥军、熊芳、李献坤、黄志强、袁智能。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 3 5 4-2 0 0 4进出口蜂蜜中咖啡因含量检验 方法液相色谱法范 围本标准规定了进出口蜂蜜中咖啡因含量检验的抽样、制样和液相色谱测定方法。本标准适用于进出口蜂蜜中咖啡因含量的检验。2 抽样 和制样21 检验批 以不超过 1 0 0 0 件(或 2 5 t)为一检验批。同一检验批的商品应具有相同的特性，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数f 抽样数量见表 1.表 1
3、单 位 为件批 量最 低抽 样 数1-1 011 1-5 055 1-1 0 01 01 0 1-5 0 0每增加1 0 0，增取55 0 1 以 上每增加1 0 0.增取22.3抽样工具2.3.1 取样管:不锈钢管，长约 1 1 5 c m，内径约2.5 c m;玻璃管，长约 1 1 5 c m，内径约 2.5 c m.2.3.2 混样器:搪瓷桶(或杯)。2.3.3 样品瓶.5 0 0 mL具塞广口玻璃瓶。2.4 抽样方法 按 2.2 规定的抽样件数随机抽取，逐件开启将玻璃管缓缓从开口处放人直至桶底，吸取样品。如遇蜂蜜结晶，用不锈钢管缓缓插人，直至桶底，吸取样品。每件抽取样品不少于 1 0
4、0 g作为原始样品。将所取样品倾人混样器内，混合均匀，分出约 1k g，装人清洁干燥的样品瓶内，加封后，标明标记，及时送交实验室。如属瓶装蜂蜜，按应开件数，从每件中随机取一瓶，标明标记，及时送交实验室。2.5 试样制备 将取回样品充分搅匀，均分成两份，装人试样瓶中作为试样，密封，标明标记。如取回样品中有结晶析出，则将样品瓶加盖后，置于不超过 4 0 的水浴中温热。待结晶全部融化后，启盖，充分搅匀，均分成两份，密封，并标明标记。如属瓶装蜂蜜，将取回的全部蜂蜜，倒在一起，充分搅匀，分取出约 1 k g 代表性样品。再将 1 k g 代表性样品经搅匀后，均分成两份，装人试样瓶中作为试样，密封，标明标
5、记。在抽样和制样的操作过程S N/T 1 3 5 4-2 0 0 4中，应防止样品受到污染或发生含量的变化。2.6试样保存 将试样于室温下保存。测定方法3.1 方法提要 样品中咖啡因在碱性条件下，用三抓甲烷提取，提取液经净化、浓缩后，用配有紫外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量.3.2 试剂和材料 所有试剂除特殊注明外，均为分析纯，水为重蒸馏水。3.2.1 乙睛:液相色谱纯或相当者。3.2.2 冰乙酸:9 9.9 0 0,3.2.3 三抓甲烷。3.2.4 氢氧化钠水溶液:称取 5.0 g 氢氧化钠用 1 0 0 mL水溶解。3.2.5 咖啡因:纯度)9 9.5 环。3.2.6 标准溶液(1 m
6、 g/m L):准确称取0.1 g(准确至。.0 0 0 1 g)咖啡因标准品，用水溶解并定容至1 0 0 MI，作为标准储备液。再根据需要用水将标准储备液稀释至适当浓度。3.3 仪器和设备3.3.1 高效液相色谱仪配紫外检测器。3.3.2 旋涡混匀器。3.3.3离心机:4 0 0 0 r/mi n,3.3.4 多功能微量化样品处理仪或类似者。3.4 测定步骤3.4.1 提取、净化 准确称取 2 0 g(准确至。.0 1 g)试样于 5 0 mL具塞离心管中，加人1 0 mL氢氧化钠水溶液混匀，然后定量加人 2 0.0 mL三氯甲烷，加塞，在旋涡混匀器上混匀 5 m i n.于2 0 0 0
7、r/m i n离心5 mi n，将上层水相用尖嘴吸管吸取弃去，有机相再用 2 X5 mL氢氧化钠水溶液洗涤两次，弃去水相;将有机相在旋涡混合器上混匀，用干燥滤纸过滤，弃去初液 3 mL，收集滤液，定量取滤液 1 0.0 mL，于 4 5 空气流下浓缩至近干，定量加人 2.0 mL水溶解残渣，过。.4 5 K m微孔滤膜后，上液相色谱仪测定，外标法定量。3.4.2测定3.4.2.1 色谱条件 a)色谱柱:O D S C 1 8 柱，2 5 c m X 4.6 m m(内 径)X 5 y m或类似柱;b)流动相:乙睛:水:乙酸(1 6+8 3+1);c)流速:0.5 0 mL/mi n;d)检测
8、波长:2 7 3 n m;e)进样量,2 0 I L;f)柱温;4 0 0C。3.4.2.2 色谱测定 根据样液中咖啡因的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中的咖啡因的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，咖啡因的保留时间约为8.8 mi n，标准品色谱图参见附录A,3.4.3 空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。2S N/T 1 3 5 4-2 0 0 43.5 结果计算和表述 用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中咖啡因的含量，计算结果需扣除空白值。(1V-式中:X 试样中咖啡因的含量，单位为毫克每千克(
9、m g/k g);A 样液中咖啡因的峰面积，单位为平方毫米(m m);c,标准工作液中咖啡因的浓度，单位为微克每毫升(p g/-L);A.标准工作液中咖啡因的峰面积，单位为平方毫米(m m);V 样液最终定容体积，单位为毫升(m L);二 最终样液所代表的试样量，单位为克(9)。测定低限、回收率4.1 测定低限 本方法的测定低限为。.0 2 5 m g/k g,4.2 回收率 蜂蜜中咖啡因的添加浓度及其回收率的实验数据:在0.0 2 5 m g/k g 时，回收率为9 3.2%;在0.0 5 0 m g/k g 时，回收率为9 6.0%;在 1.0 mg/k g 时，回收率为9 8.4 0 a
10、,S N/T 1 3 5 4-2 0 0 4 附录A(资料性 附录)标 准品色谱图.A b s I不一:h l 2 7 3 n m团囚团哭网誉月图 A.咖啡因标准品的液相色谱 图S N/T 1 3 5 4-2 0 0 4F o r e wo r d A n n e x A o f t h is s t a n d a r d a r e i n f o r ma t i v e a n n e x.T h is s t a n d a r d w a s p r o p o s e d b y a n d is u n d e r t h e c h a r g e o f N a t i o
11、 n a l R e g u la t o r y C o m mi s s io n f o rC e r t if i c a t i o n a n d Ac c r e d it a t i o n.T h i s s t a n d a r d w a s d r a f t e d b y H u n a n E n t r y-E x i t In s p e c t i o n a n d Q u a r a n t i n e B u r e a u o f t h e P e o p le sR e p u b li c o f C h i n a.T h e m a in
12、 d r a f t e r s o f t h i s s t a n d a r d a r e D a l H u e,L i Y o n g j u n,X i o n g F a n g,L i X ia n k u n,H u a n gZ h iq ia n g a n d Y u a n Z h i n e n g.T h is s t a n d a r d i s a p r o f e s s io n a l s t a n d a r d p r o m u lg a t e d f o r t h e f i r s t t i m e.N o t e:T h i
13、s E n g li s h v e r s io n,a t r a n s l a t io n f r o m t h e C h i n e s e t e x t,i s s o l e ly f o r g u i d a n c eS N/T 1 3 5 4-2 0 0 4D e t e r min a t i o n o f c a f f e in e i n h o n e y f o r i mp o r t a n d e x p o r t-L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y1 S c o p eT h is s t a n
14、 d a r d s p e c i f i e s t h e m e t h o d s o f s a mp l i n g,s a mp l e p r e p a r a t io n a n d d e t e r min a t io n o f c a f f e i n ec o n t e n t s i n h o n e y f o r e x p o r t b y l i o u id c h r o ma t o g r a o h v.T h i s s t a n d a r d i s a p p l ic a b le t o t h e d e t e
15、r m i n a t io n o f c a f f e in e c o n t e n t s in h o n e y f o r e x p o r t b y l iq u idc h r o m a t o g r a p h y.2 S a mp l i n g a n d s a m p l e p r e p a r a t i o n2.1 I n s p e c t i o n l o tE a c h i n s p e c t io n l o t s h o u ld n o t e x c e e d 1 0 0 0 p a c k a g e s(o r 2
16、 5 t).T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c a r g o wit h in t h e s a me i n s p e c t io n lo t,s u c h a s p a c k i n g,ma r k,o r ig i n,s p e c i f i-c a t i o n a n d g r a d e,s h o u ld b e t h e s a me.2.2 Q u a n t i t y o f s a m p l e t a k e nQ u a n t i t y o f s a mp le t a k e n s e e t a b le 1.Ta b l e 1N u mb e r o f p a c k a g e s i n a n in s p e c t io n l o tMin imu m n u mb e r o f p a c k a g e s t o b e t a k e n1-1 011 1 -5 05 1-1 0 01 01 01 -50 05 mo r e p