1、i c s 1 1.2 2 0B4 1.Y中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 3 8-2 0 0 2鸡传染性鼻炎诊断技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r i n f e c t i o u s c o r y z a2 0 0 2 一 0 8 一 2 7 发布2 0 0 2 一 1 2 一 0 1实施中 华 人 民共 和 国 农 业 部发 布N Y/T 5 3 8-2 0 0 2前言 鸡传染性鼻炎(I C)是由副鸡嗜血杆菌(h p g)引起的一种鸡的急性上呼吸道传染病，本病在世界各地均有发生，主要引起蛋鸡产
2、蛋率下降、生长发育鸡群的生长受阻及淘汰率增加，造成很大的经济损失。副鸡嗜血杆菌通常分为A,B,C三个血清型，在我国能引起传染性鼻炎的菌型目前为A型和C型，它们具有共同抗原和各自的型特异性抗原，可以通过检测这些型特异性抗原来鉴定h p g的血清型。本标准提供了多种诊断鸡传染性鼻炎的方法，在使用中应根据鸡群发病后至诊断时的间隔时间长短及使用单位的具体情况选择使用。建议在鸡群发病早期采用病原的分离鉴定或聚合酶链反应(P C R)方法进行诊断，感染一周以后可以采用血清平板凝集试验进行诊断，两周后可以采用琼脂扩散试验、间接酶联免疫吸附试验(E L I S A)和阻断E L S I A进行诊断，三周后以上
3、各种检查抗体的方法均可使用。本标准的附录A、附录B,附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:北京市农林科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:苗得园、陈小玲、张培君、陈葵、宋程、龚玉梅。N Y/T 5 3 8-2 0 0 2鸡传染性鼻炎诊断技术1 范围 本标准规定了检测副鸡嗜血杆菌的细菌分离鉴定方法、P C R技术以及检测副鸡嗜血杆菌特异性抗体的血清平板凝集试验、血凝抑制试验、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验的操作方法。本标准适用于鸡和其他易感动物的传染性鼻炎的诊断。2 细菌的分离鉴定2.12
4、.1.12.1.22.22.2.12.2.2纵线。2.2.32.2.42.2.5材料准备 无菌棉拭子、鲜血琼脂平板培养基 产烟酞胺腺嘿吟二核昔酸(或辅酶操作程序 N A D)表皮葡萄球菌。无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中粘液或浆液。用棉拭子在鲜血琼脂平皿上横向划线 5-7 条，然后取产 N A D表皮葡萄球菌从横线中间划一将划种好的平皿置于5%的二氧化碳(C O Q)培养箱中3 7 培养1 8 h-2 4 h.观察菌落特点。取分离物做过氧化氢酶试验，必要时通过进一步的生化反应做详细的特征鉴定。副鸡嗜血杆菌的生化反应特点及过氧化氢酶试验方法见附录A,2.2.6 也可采用P C R鉴
5、定可疑菌落，同时取病料或可疑菌落进行动物试验，方法见附录B,2.3 结果判定与表示方法 若鲜血琼脂培养基上出现“卫星样”生长的露滴状、针头大小的小菌落，即靠近产N A D表皮葡萄球菌线处菌落较大，直径可达0.3 m m，离产N A D表皮葡萄球菌线越远，菌落越小，过氧化氢酶阴性，结果判为阳性，记为“+”，若无卫星现象，但有露滴状、针头大小的小菌落出现且过氧化氢酶阴性，则仍需采用 P C R或动物试验鉴定，以避免漏检不需 N A D的副鸡嗜血杆菌。若无上述现象，则判为阴性，记为3 聚合酶链反应(P C R)技术3.1 材料准备11.1 P C R反应液、消化液、阴、阳性对照物，按说明书保存和使用
6、。3.1.2 石蜡油、生理盐水、蒸馏水、1.5 m L及0.5 m L小离心管、吸头若干，均经灭菌处理。3.1.3 P C R仪、5 6 水浴锅、微量加样器、小型高速离心机、冰块等。3.1.4 琼脂糖、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪。3.1.5 1 0 m g/m L嗅化乙 锭，加样缓冲液，T A E电泳缓冲液，配制方法见附录C e3.2 操作程序3.2.1 P C R临床样品的采集 无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中 粘液或浆液，浸人含。.8 m L-1.0 m L生理盐水的1.5 m l离心管内，室温放置。.5 h 后，将棉拭子在管壁上尽量挤干，然后弃至消毒液缸中。NY/r 5
7、 3 8-2 0 0 23.2.2 P C R临床样品的预处理 将浸过棉拭子的离心管以8 0 0 0 r/m i n-1 0 0 0 0 r/m i n离心 1 0 m i n，小心吸去大部分上清液，保留2 0 川 左右液体(若原始样品中混有血液，可2 0 0 0 r/m i n 离心3 m i n-5 m i n，使血球沉于管底，将上清液转到新管里，再高速离心)。经上述处理过的样品，可开始消化，或在一2 0 保存。3.2.3 P C R临床样品消化 用吸头将离心管中沉淀物与剩余液体混合均匀，从中取 1 k L置于含9 p L P C R消化液的0.5 m L小离心管中(注意:做不同样品时应换
8、吸头)，然后压紧离心管盖，5 6 水浴1 h，然后 9 5 0C 1 0 m i n，再冰浴 1 0 mi n后进行 P C R扩增或置一2 0 保存。3.2.4 P C R菌落样品制备 挑取平皿上的可疑菌落，加到含 1 0 p L蒸馏水的0.5 m L的小离心管中，压紧管盖，9 5 加热1 0 m i n，再冰浴1 0 m i n 后进行P C R扩增或一2 0 保存。3.2.5 P C R阴阳性对照样品制备 用1 0 夙 消化液作为阴性对照样品，用9 y L 消化液加1 k L已知阳性对照物作为阳性对照样品。5 6 C 水浴1 h，然后 9 5 C 1 0 m i n，再冰浴 1 0 m
9、i n 后进行P C R扩增或置一2 0 保存。3.2.6 P C R扩增 将样品管瞬时离心，使附着于管顶、壁上的掖滴沉下，然后加人 1 5 CA L P C R反应液，使总体积为2 5 V L。再瞬时离心，然后加人5 0 p L 矿物油硬盖，置P C R仪上进行扩增反应。程序为9 4 0C 1 m i n,6 5 0C1 m i n,7 2-C 2 m i n 循环 2 5 次;9 4 C 1 m i n,6 5 0C 1 m i n,7 2 0C 1 0 m i n 循环一次。3.2.7 琼脂精凝胶电泳 按照附录D制备。.7%的琼脂糖凝胶，从各P C R反应管中分别取1 0 p L反应产物
10、与2 p L加样缓冲液混合均匀，然后加人到样品孔中。初次操作时应设置D N A分子量对照，6 0 V-8 0 V稳压电泳3 0 m i n-5 0 m i n，至加样缓冲液的染料带走出2 c m-3 c m时停止电泳。3.2.8 结果 在紫外检测仪下观察结果，必要时可拍照保存。3.3 结果判定与表示方法 阳性对照样品应呈现一条。.5 k b的D N A带，阴性对照样品不应有这条带，被检样品若出现与阳性对照同样大小的一条D N A带，则判为阳性，记作“+”，若无此带，则判为阴性，记为“一”。阴、阳性对照应分别出现阴、阳性结果，否则，全部样品应该重做。4 血清平板凝集试验4 门材料准备4.1.1
11、鸡传染性鼻炎平板凝集试验抗原、阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用，使用前与被检血清一起恢复至室温。4 门.2 试验用玻板(也可用载玻片)、可调微量加样器 1 个、灭菌吸头若干、记号笔。4.2 操作程序4.2.1 本试验在室温(2 0 C-2 5 C)进行。4.2.2 先在玻板背面写好编号，每个样品间至少留2 0 m m空隙，再在每个序号边加抗原1 5 p L4.2.3 按玻板上的序号加对照或被检血清1 5 爪，每个血清样品换一个吸头，将血清与抗原混匀，反应持续3 m i n-5 m i n，在此时间内观察结果。每次试验均设阴、阳性对照。4.2.4 在黑色背景或在灯下明亮处观察并记录结果4.3
12、 结果判定与表示方法 判定标准见表 1,N Y/T 5 3 8-2 0 0 2表 1 血清平板凝集试验判定标准编号反 应 表 现判定记录符号定性区分I有明显架状或片状凝集片，液体清亮强阳性+z有大量针头样顺粒，量多，液休较清亮阳性+3针头样顺粒状，量较少，稍混浊弱阳性+4液体无颗粒，均匀而混浊阴性出现 1,2,3 号反应者为阳性，出现4 号反应者为阴性。5 血凝抑制试验5.1 材料准备5.1 门鸡传染性鼻炎血凝抑制试验抗原、阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用。5.12 生理盐水及被检血清。5.1.3 新鲜红血球悬液及醛化红血球悬液，制备方法见附录E,5.1.4 9 6 孔微量血凝板(v型)、
13、微量振荡器、微量加样器及吸头若干。5.2 操作程序5.2.1 本操作最好在 2 0 C-2 5 范围内进行，同时用A,B,C型抗原分别对被检血清进行以下操作，以全面检出各型菌的感染。5.2.2 取洁净血凝板，将抗原用生理盐水从 5 倍开始做两倍递增稀释加人 1-1 1 列孔中(即第 1 列孔为5 X，第2 列为1 0 X,第3 列为2 0 X，依此类推至第1 1 列)，每孔最终液体量为1 0 0 p L，第1 2 列孔只加生理盐水作为血球对照孔。5.2.3 每孔加1%醛化红血球(A型抗原可用新鲜红血球)1 0 0 p L,5.2.4 充分振荡混合后，在室温静置 3 0 m i n-6 0 m
14、i n(至血球对照孔中红血球完全沉下为准)。5.2.5 判定抗原的血凝价(H A效价)。即为使红血球发生完全凝集的抗原最大稀释倍数。5.2.6 被检血清的吸收:将被检血清用1 0%的鸡醛化红血球做5 倍稀释，室温下作用 4 h 或4 过夜，中间充分振荡不少于5 次，然后 1 5 0 0 r/m i n 离心 1 0 m i n，取上清液即为5 倍稀释的被检血清。5.2.7 取洁净血凝板，从第 1 列孔开始，用生理盐水将每份被检血清及阴、阳性对照血清从 5 倍开始做两倍递增系列稀释，每行测定一份血清，每孔最终液体量为5 0 p L,将抗原用生理盐水稀释至浓度为 4 个 H A效价单位(如H A效
15、价为 1，每血清孔中 加人5 0 p L,1 6 0，则抗原稀释至充分振荡，于室温下感做3 0 m i n以上。每孔加人1 环的醛化红血球 1 0 0 y L(A型抗原可加新鲜红血球)。充分振荡，置室温下作用3 0 m i n-6 0 m i n,分别判定被检血清样品血凝抑制(H I)效价，即完全抑制红血球凝集的最高血清稀释倍数。1011.12 结果的判定与裹示方法能完全抑制红血球凝集者判为阳性(H I 效价)5),阴、阳性对照血清的结果应分别为阴性和阳性琼脂双向双扩散试验勺亡乙八了口曰 .JJlJl卜口6.1 材料准备6.1.1 鸡传染性鼻炎琼脂扩散试验抗原、阴、阳 性对照血清，按说明书保存
16、和使用。6.1.2 琼脂糖:含。.0 1%硫柳汞、8 YoA化钠的磷酸盐缓冲液(P B S)(0.0 1 m o l/L p H 7.4)6.1.3 微量加样器及吸头若干、打孔器、针头。N v/T 5 3 8-2 0 0 26.2 操作程序6.2.，琼脂板的制备:取琼脂糖1.0 g，加到1 0 0 m L含硫柳汞的P B S 溶液中加热熔化，待冷却至4 5 C-5 0 时倒平皿，厚度3 m m左右，注意勿倒出气泡。6.2.2 打孔:先在纸上画好梅花形的七孔图(见图1)。将含琼脂的平皿放置图上，用金属打孔器在琼脂上打孔，每孔直径5 m m，孔距 3 m m，打孔后吸出或挑出孔内琼脂块，然后将平皿置酒精灯上微微加热封底 000 图 1 梅花形七孔示意圈6.2.3 加样:用微量加样器吸取抗原滴加于其余中央孔，取等量阳性血清对照分别加到1,4 孔，被检血清分别滴加于周边孔(可将被检血清系列稀释加人不同孔中测其琼扩效价)。各孔以加满不溢出为度。每次试验可设 1-2 孔阴性对照。6.3 结果判定与表示方法 在黑色背景或灯光下观察结果，阳性血清对照孔与抗原之间应出现清晰的沉淀线，阴性对照孔与抗原之间