1、I C S 1 1.2 2 0B 4 1NY中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 5 3-2 0 0 2禽支原体病诊断技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r a v i a n my c o p l a s mo s i s(m y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m)2 0 0 2 一 0 8 一 2 7发布2 0 0 2 门2 一 0 1实施中 华 人 民共 和 国农 业 部发 布N Y/T 5 5 3-2 0 0 2目 11舀 禽支原体病(a v i a n
2、 m y c o p l a s m o s i s)又称鸡败血支原体(m y c o p l a s m g a l l i s e p t i c u m，简称M G)，常引起鸡的慢性呼吸道疾病。M G也可感染火鸡，引起传染性窦炎。世界动物卫生组织仁 w o r l d O r g a n i z a t i o nf o r A n i m a l H e a l t h(英),O f f i c e I n t e r n a t i o n a l d e s E p i z o o t i e s(法),O I E 将本病例B类动物疫病，我国 将其列为二类疫病。本标准规定的方法与O
3、 I E 诊断试验与疫苗标准手册 推荐相应方法一致。本标准的附录A为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:农业部动物检疫所。本标准起草人:郭福生、尹燕博、蒋正军、孙淑芳、陆明哲、龚振华。N Y/T 5 5 3-2 0 0 2禽支原体病诊断技术1 范围 本标准规定了禽支原体(MG)分离鉴定和快速血清凝集试验(R S A)的技术要求。本标准适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测。2 禽支原体的分离和鉴定21 材料准备2.1 门培养基制备见附录A(规范性附录)。2.1.2 兔抗MG阳 性血清和抗免荧光抗体结合物。2.2 分离2.2.1 采样 活
4、禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气囊采样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。对于鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。2.2.2 样品的处理 采样后应尽快培养。如须运输，小块组织置于支原体培养基中，拭子在培养基中用力搅拌数次，将培养基运回实验室尽快培养。2.2.3 接种 将样品0.2 m I 一 接种于1.8 mI支原体液体培养基中，依次1 0 倍稀释至1 0-3，密封，3 T C 培养。同时将样品接种于支原体固体培养基中，置于含5%-1 0%二氧化碳(C O Q)培养箱中培养。2.2.3.1 每天检查液体培养基酸碱度，一旦发现p H值变化，立即接
5、种于固体培养基中培养。若培养基酸碱度没有变化，每隔3 d-5 d盲传一代，共传3 代，培养 1 0 d 后接种于固体培养基上培养2.2-3.2 固体培养基上若有菌落生长，用低倍显微镜观察菌落，可见中央突起呈荷包蛋样(有时不典型)，需进一步作血清学鉴定。2.3 鉴定2.3.1 用间接荧光抗体试验Q F A)鉴定MG.取 1.0 c m-1.5 c m的琼脂块，菌落面朝上置于载玻片上，第一块载玻片上放一块待检分离物、一块已知MG菌落(S 或R株)、一块已知其他支原体菌落，第二块载玻片上放一块待检分离物。2.3.2 第一块载玻片上每块琼脂块上加一滴适当稀释的兔抗M G血清，第二块载玻片上琼脂块上加一
6、滴正常兔血清。2.3.3 琼脂块在湿盒中室温条件下反应3 0 m i n 后，分别放到含有磷酸盐缓冲液(P B S)(p H 7.2)的不同器皿中，冲洗 1 0 m i n，共冲洗 2 次。2.3.4 将琼脂块放回原玻片.吸水纸吸取过多的水分，每块琼脂加上稀释好的抗兔荧光抗体结合物，反应、洗涤同前，最后将琼脂块放回玻片，吸干多余水分后于人射式荧光显微镜下检查结果2.4 结果判定 菌落呈现亮绿色荧光时为阳性反应，若仅有暗淡的菌落轮廓，与背景荧光颜色差别不大为阴性。其他已知支原体菌落、第二块载玻片分离物为阴性;第一块载玻片分离物、与己知MG菌落为阳性结果时，证明分离物为鸡毒支原体。N Y/T 5
7、5 3-2 0 0 23 快速血清凝集试验(R S A)3.1 从鸡群采集的血清样品，如不能立即进行试验，应 4 保存，不能冻结。3.2 试验用染色抗原、阳性及阴性对照血清。3.3 操作方法:室温中加一滴(2 0 V L)血清于白瓷板或玻板上，再加等量染色抗原，用棉签或火柴棒将其混合，轻轻摇动玻板使之混合均匀。试验设阳性血清及阴性血清对照。3.4 结果判定:室温条件下，5 6 C 3 0 m i n 处理后的鸡血清2 m i n内，火鸡血清3 m i n内判定结果。规定时间内，发生完全凝集的，判为阳性。如仅在液滴边缘部分出现凝集，或超过2 m i n(火鸡 3 m i n)在边缘出现凝集，判为
8、可疑。超过规定时间无凝集者，判为阴性。N Y/T 5 5 3-2 0 0 2 附录A (规范性附录)支原体培养墓的制备A.1 支原体肉汤培养基A.1.1 新鲜酵母浸出液的制备:称取 2 5 0 g 具有活性的鲜酵母，悬浮于1 0 0 0 m L蒸馏水中，加热至沸点，冷却。3 0 0 0 r/mi n离心2 0 mi n,T IK出上清液，用0.1 mo l/L氢氧化钠(N a O H)调p H至7.8-8.0。过滤除菌，置4 C保存备用。A.1.2 甲液:不含结晶紫的支原体(P P L O)肉 汤培养基(D i f c o)1 4.7 g，加蒸馏水或去离子水7 0 0 m L,A.1.3 乙液
9、:猪血清(5 6 灭活 3 0 m i n)1 5 0 m L，质量浓度为 2 5%新鲜酵母浸出液 1 0 0 m l，质量浓度为1 0%葡萄糖溶液 1 0 m l，质量浓度为 5%乙酸铭 1 0 m L,2 0 0 0 0 0 I U/m I青霉素G 5 m L，质量浓度为0.1%酚红2 m l。将以上各种成品混合即乙液(也可用犊牛血清或马血清代替猪血清)。将甲液经1 2 1 k P a 灭菌1 5 m i n，冷却后加人乙液调p H值至7.8,即为支原体肉汤培养基。A.2 支原体固体培养基 取不含支原体生长抑制物的纯琼脂1 0 g，加人到上述甲液中，混合后如前所述高压灭菌，置5 6 水浴中。然后加人乙液，小心混匀，避免产生气泡，然后倒人平皿中厚度约0.4 c m，冷却后备用。