1、ICS 65.150 B 52 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 14152011 鱼类寄生虫性疫病诊断技术规程 Diagnosis protocal for parasite epidemics of fish 2011-06-15 发布 2011-06-30 实施河北省质量技术监督局 发 布 DB13/T 14152011 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河北省水产局提出。本标准起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。本标准主要起草人：张志华、侯金良、李同庆、康辰香、孙伟彬、石洁卿、马瑞欣、邵铁凡、寇景莲。DB13/T 14152011 1
2、鱼类寄生虫性疫病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鱼类寄生虫性疫病即小瓜虫病、刺激隐核虫病、粘孢子虫病、三代虫病、指环虫病的诊断技术。本标准适用于小瓜虫病、刺激隐核虫病、粘孢子虫病、三代虫病、指环虫病的诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 OIE水生动物疾病诊断手册 3 通则 3.1 材料和试剂 3.1.1 材料 普通光学显微镜、双筒解剖镜、放大镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术刀、手术剪、解剖针、吸水
3、纸、培养皿、滴管、解剖盘等。3.1.2 试剂 0.85生理盐水、30人工配制海水、45%和10的福尔马林、70酒精、硝酸银、甘油胶胨、肖氏液、聚乙烯醇。配置试剂用水应符合GB/T 6682的要求。3.2 采样量 用于检查诊断的鱼应有一定数量，检查时采集的样品至少5尾10尾。也可按照OIE水生动物疾病诊断手册的采样方法进行采样，见附录A。3.3 样品及运输 用于实验室检查的病鱼应是活体，运输时应在采集的病鱼中加注原池水进行活体运输。每个容器只装运同一种病鱼送至实验室。运输过程中应采取充氧、降温等措施。3.4 病原体记数 按不同感染部位采集组织，进行观察。记录显微镜检查时的倍数和该倍数下的虫体数量
4、。孢囊用数字说明，虫体数为同一玻片中3个视野的平均数。DB13/T 14152011 2 4 小瓜虫病 4.1 病原种类特征 见附录B。4.2 现场样品目检 检查鱼体。病鱼体色发黑，消瘦，游动异常，体表或鳃上可见1 mm左右的小白点，病情严重时，鱼体表伴大量粘液，用镊子刮下白点或粘液，放在解剖盘上，滴一滴生理盐水，静置1 min2 min，在光亮的地方仔细观察，如果见到一个个白色小圆球在慢慢地游动，且大多数集中在水滴的边缘，根据上述的症状可以初步确诊。4.3 实验室检测及标本保存 4.3.1 体表 用解剖刀刮取体表两侧粘液，置于载玻片上，滴一滴生理盐水，用镊子将组织粘液分散，盖上盖玻片，用拇指
5、轻轻压片，在显微镜或解剖镜下检查。4.3.2 鳍 目检正常的鱼，剪下各鳍，置于载玻片上，滴一滴生理盐水，解剖镜下检查。目检鱼体各鳍如有溃烂或白点，用镊子刮取溃烂或白点部位，置于载玻片上，滴一滴生理盐水，用盖玻片盖上轻压，解剖镜或显微镜下检查。4.3.3 鳃 用剪刀将左右两边的鳃完整地取出，放在培养皿里（要分开放置），并附上左右标记。剪取一小块鳃组织（应从每一边鳃的第一片鳃片接近两端的位置剪取），放在载玻片上，滴一滴生理盐水，盖上盖玻片轻压，在解剖镜或显微镜下检查。如鳃上肉眼可见白点或孢囊，则用镊子刮取白点或孢囊，或取整片鳃丝压片，显微镜下检查。4.3.4 虫体收集保存 见附录C。4.4 结果判
6、定 目检症状结合镜下观察，40倍显微镜下平均每视野内小瓜虫计数达到10个及10个以上时，判定为小瓜虫病；小瓜虫计数不足10个时，判定为小瓜虫感染。5 刺激隐核虫病 5.1 病原种类特征 见附录B。5.2 现场样品目检 滴加试剂为30人工配制海水，其他步骤同4.2。DB13/T 14152011 3 5.3 实验室检测及标本保存 诊断时滴加试剂为30人工配制海水，其他步骤同4.3。5.4 结果判定 目检症状结合镜下观察，40倍显微镜下平均每视野内刺激隐核虫计数达到10个及10个以上时，判定为刺激隐核虫病；刺激隐核虫计数不足10个时，判定为刺激隐核虫感染。6 粘孢子虫病 6.1 病原种类特征 见附
7、录B。6.2 现场样品目检 粘孢子虫的多数种类，寄生于鱼的体表、鳃、肠道及体腔，都表现出肉眼可见的症状，即白点状或白色的瘤状孢囊，孢囊形状和大小不规则，颜色灰白而不透明。用镊子取下一个孢囊放在载玻片上，滴一滴生理盐水，用盖玻片盖上轻压，如孢囊破裂并流出乳白色液体，可初步诊断为粘孢子虫病。6.3 实验室检测及标本保存 6.3.1 镜检 在400倍显微镜下，压破的孢囊液体中清晰可见孢子，可诊断为粘孢子虫病。一个孢囊中有成千上万个孢子虫。6.3.2 体表 检查体表，用解剖刀刮取鳞片下的瘤状物，置于载玻片上，加一滴生理盐水，盖上盖玻片轻压，显微镜下检查。6.3.3 鳍 检查方法参见4.3.2，镜检倍数
8、为400倍。6.3.4 鳃 检查方法参见4.3.3，镜检倍数为400倍。6.3.5 体腔 打开鱼体腹腔，仔细观察显露出的部位有无可疑病变。如发现白点，或较大孢囊，有可能是粘孢子虫寄生。用镊子刮取白点部位或孢囊置于载玻片上，滴一滴生理盐水，盖上盖玻片轻压，见孢囊破裂后，显微镜下检查。6.3.6 肠道 将肠道外壁上所有脂肪去除干净，把肠前后伸直摆在解剖盘上。将肠分为前、中、后三段，各取一段，用剪刀从与肠平行的方向剪开一个小小切口，用镊子从切口上取一小滴内容物放在载玻片上，滴一滴生理盐水，盖上盖玻片轻压，显微镜下检查，每段同时检查两片标本。DB13/T 14152011 4 剪开肠道后，如见白点或孢
9、囊附着，直接用解剖刀刮取白点或孢囊于在载玻片上，压片后，显微镜下检查。6.3.7 虫体收集保存 见附录C。6.4 病原体记数及结果判定 6.4.1 病原体记数 6.4.1.1 计数符号用“+”表示：“+”表示有；“+”表示多；“+”表示很多。6.4.1.2 高倍显微镜 400 倍一个视野下，有 1 个20 个虫体时记“+”，21 个50 个虫体时记“+”，50 个以上的虫体时记“+”。6.4.2 结果判定 检出粘孢子虫则判定为粘孢子虫病。7 三代虫病 7.1 病原种类特征 见附录 B。7.2 现场样品目检 当虫体大量寄生时，病鱼体表可见一层灰白色的粘液，鱼体失去光泽，游动极不正常。7.3 实验
10、室检测及标本保存 该病不会出现白点或孢囊，无须此步检测。其他步骤参见4.3。7.4 结果判定 目检症状结合镜下观察，40倍显微镜下平均每视野内三代虫计数达到5个及5个以上时，判定为三代虫病；三代虫计数不足5个时，判定为三代虫感染。8 指环虫病 8.1 病原种类特征 见附录B。8.2 现场样品目检 同7.2。8.3 实验室检测及标本保存 同7.3。DB13/T 14152011 5 8.4 结果判定 目检症状结合镜下观察，40倍显微镜下平均每视野内指环虫计数达到5个及5个以上时，判定为指环虫病；指环虫计数不足5个时，判定为指环虫感染。DB13/T 14152011 6 A A 附 录 A（资料性
11、附录）采样数量 表A.1 检疫采样数量表 鱼群大小 2感染率时取样 5感染率时取样 10感染率时取样 50 50 35 20 100 75 45 23 250 110 50 25 500 130 55 26 1000 140 55 27 1500 140 55 27 2000 145 60 27 4000 145 60 27 10000 145 60 27 100000 或以上 150 60 30 注：检疫采样应采集全部实验室样品。DB13/T 14152011 7 B B 附 录 B（资料性附录）病原种类特征 B.1 多子小瓜虫 B.1.1 成虫期 虫体一般呈卵形或球形，大小(350800)
12、m(300500)m，胞口在接近前端的腹面上。大核香肠状或马蹄状，小核紧帖大核上，细胞质有很多小的伸缩泡和一些食物粒。B.1.2 幼虫期 身体一般呈椭圆形，随着发育时间的延长身体逐渐变长，变成扁鞋底状，在前端有一乳头状突起，叫钻孔器，前端较圆，除身体后端有1根特长的尾毛外，周身长着长短一致的纤毛。在腹面稍前的位置，有1个近似“6”字形的小胞口。在身体前半部有一个大的伸缩泡。B.1.3 包囊期 离开鱼体的虫体或越出囊泡的虫体，可作3 h6 h的游泳，然后沉入水底的物体上，静止之后，分泌一层胶质厚膜将虫体包围即是包囊。包囊圆形或椭圆形，白色透明。B.2 刺激隐核虫 B.2.1 寄生滋养体 成熟的虫
13、体呈球形或卵圆形，直径约300 m500 m，显微镜下常呈乳白色，体被纤毛，表面有脊状突起，胞口位于身体的前端，体内有4个8个卵圆形团块连接成“”字形排列的念珠状大核。虫体会随运动改变形状。B.2.2 胞囊 虫体从宿主体表脱落后，纤毛退化，表面的脊状突起变平，形成厚壁胞囊，大小为94.5 m170 m252 m441 m。B.2.3 幼虫 卵圆形或纺锤型，前端稍尖，大小为20 m30 m50 m70 m，其形态大小随地域、宿主种类和温度的不同而有所变化。B.3 粘孢子虫 主要致病种类有：B.3.1 变异粘体虫（M.varia Achmerov Nie&Lee,1964)DB13/T 14152
14、011 8 营养体外观不规则，大小不一。成熟孢子壳面观为椭圆形，前端较后端宽或钝圆。后端壳缘光滑，或有45个V形皱褶。极囊2个，梨形或卵圆形，大小相等，平行排列于前方，约占孢子长的1/2。少数极囊不等，斜向排列于前。极丝在极囊内盘绕59圈。孢中质有圆形胚核2个。无嗜碘泡。顶面观纺锤形。缝面观亦为纺锤形，缝脊直或稍弯曲。孢子长9 m13 m，宽6 m8.5 m。孢囊形状大小不一，有椭圆形、扇形块状、长条形或分枝不规则等。B.3.2 中华粘体虫（M.sinensis Nie&Lee,1964)成熟的孢子圆形，前方稍尖，后方钝圆，缝脊直。两个梨形极囊同等大小。无嗜碘泡。感染的鱼肠道内壁或外壁形成乳白
15、色芝麻状孢囊。B.3.3 鲢碘泡虫（M.drjagini）(1954)(Schulman,1962)营养体直径4.8 m16.0 m.。孢子壳面观椭圆或倒卵形，前宽而后稍狭。壳面光滑或有45个V形的褶皱，囊间有明显V形小块。孢子长12.3 m，宽9.0 m。极囊2个，梨形，通常大极囊倾斜地位于孢子前方。B.3.4 饼形碘泡虫（M.artua Achmerov,1960)孢囊白色，圆形或椭圆形，长42 m89.2 m，宽31.5 m73.5 m。孢子壳面观为圆形，纵轴小于横轴，孢子后方有不甚明显的褶皱。缝面观纺锤形。孢子长4.8 m6.0 m。2个卵圆形的极囊大小相等，呈八字形排列。B.3.5
16、异型碘泡虫（M.dispar Theolohan,1895)孢子椭圆形，缝脊直而明显，两个梨形极囊大小不等，彼此有一定间隔，有一个明显的嗜碘泡。孢囊大小为29.7 m39.2 m195.8 m230 m。B.3.6 鲮单极虫（T.rohitae）(Southwell&Prashad,1918)着生于鱼体鳞片下，白色或蜡黄色，孢囊大小形状不一，有圆形、椭圆形、长方形或多角形，其长可达32 mm，短的有5 mm。孢子长29.8 m35 m，宽7 m12.3 m，极囊长19 m25 m，宽为7 m，呈长卵形，约占孢子长的1/31/2。嗜碘泡1个。孢子外面常被有一层无色透明的薄膜。B.4 三代虫 主要致病种类有：B.4.1 鲢三代虫（G.hypopthalmichthysi Ling）主要寄生于鲢、鳙的皮肤、鳍、鳃及口腔。无眼点，体长0.32 mm0.51 mm，宽0.07 mm0.14 mm前端有头器1对。后吸器上的8对边缘小钩排列呈伞状，中央大钩1对，2片联结片。口在身体前端腹面，呈管状或漏斗状。咽由16个大细胞构成，葫芦状。食道很短，肠支伸至体后的4/5处。睾丸位于体后部中间。交配囊卵圆