1、i c s 1 1.2 2 0s4 1中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 6 7 一2 0 0 2兔出血性败血症诊断技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r r a b b i t h a e mo r r h a g i c s e p t i c e mi a2 0 0 2 一 0 8 一 2 7 发布2 0 0 2 一 1 2 一 0 1实施中 华 人 民 共 和 国 农 业 部发 布5 3 5N Y/T 5 6 7-2 0 0 2前言 兔出血 性败血 症(r a b b it h a e m o r r
2、 h a g ic s e p t ic e m ia)又 称兔多杀 性巴氏 杆菌 病，是家 兔的一种重要的呼吸道传染病本病主要引起家兔的出血性坏死性肺炎.多呈最急性或急性病程迅速死亡，也有的表现为慢性、局部性病变，如结膜炎、鼻炎等。本病可发生于任何年龄的家兔，尤其在集约化养兔场，一旦发生会造成重大经济损失。本标准采用的技术与 世界动物卫生组织 Wo r l d O r g a n i z a t i o n f o r A n i m a l H e a l t h(英),O f f i c e I n t e n-t i o n a l d e s E p i z o o t i c(法)
3、,O I E 推荐的其他动物巴氏杆菌病诊断技术基本一致，本标准是参考这些技术，根据本国的研究和诊断实践经验制定的 本标准的附录A为规范性附录。本标礁由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归日。本标准起草单位:江苏省农业科学院畜牧兽K研究所。本标准主要起草人:王启明、董亚芳。N Y/T 5 6 7-2 0 0 2兔出血性败血症诊断技术1 范 围本标准规定了兔出血性败血症(兔巴氏杆菌病)的诊断技术本标准适用于本病的病原学诊断和产地检疫2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注!期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修汀版均不
4、适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 G B/T 1 4 9 2 6.5 -2 0 0 1 实验动物多杀巴斯德杆菌检测方法 NY 八1 5 6 4-2 0 0 2 猪巴氏杆菌病诊断技术3 材料和试剂11 培养丛:马丁琼脂、马丁肉汤，制备方法见附录 Ao3.2 1 6 R-2 0 R 重实验动物小白鼠4 检验程序检验程序见图t o植样血琼脂平皿3 6 士I 咖 2 4 h-4 8马r 琼脂平皿(分纯)3 6 十 I
5、 L 1I S h 2 4 h涂 片 镇 枪4 5 0折光显徽镜检查生 化 试 骏麦战凯琼脂平皿报告图 1 检验程序流程图N Y/T 5 6 7-2 0 0 25 检验具体步骤5 门采样 采取鼻咽部或气管分泌物;肺等病灶或心血。5.2 分离培养 将样品划线接种于血琼脂(见GB 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中 4-6)平皿，并置其于 3 6 C士1 C 温箱培养2 4 h-4 8 h，挑选灰白色、不溶血、光滑露滴样菌落转种于马丁琼脂(见第A.l章)平皿，置 3 6 C士1 C温箱培养1 8 h-2 4 h，挑选半透明圆润露珠状、直径1 m m-2 m m左右的菌落，在4 5。折光显微镜
6、下观察，可见周边带绿色荧光的黄红色 F o型菌落，可用于生化鉴定。多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂(见G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 中4.2 4)平皿上不生长。5.3 形态与染色 按GB/T 1 4 9 2 6.5-2 0 0 1 中5.3 规定进行。5.4 接种高层三糖铁琼脂斜面 按G B/T 1 4 9 2 6.5-2 0 0 1中5.4 规定进行。5.5 生化试验 按:B 门 1 4 9 2 6.5 2 0 0 1 t S.5 规定进行。6 动物试验6.1 自5.2马丁琼脂平皿上 挑取分离纯粹的多杀性巴氏杆菌标准单个菌落.1-5 个，接种于马丁肉汤(见第A.2 章川，试管内，
7、置 3 6 C士1 C 温箱内培养1 8 h 2 4 h，菌液含活菌数约在8 千万/m 工 一l.2 亿个/n i l,o6.2 将 F.述菌液经稀释后腹腔注射小白鼠3只心血中分离出原接种菌，以证实分离菌有致病力，每只约为 1 0 0 0个菌体，小白鼠应于7日内死亡，并自了 结果判定根据以 卜 生物特性、生化试验和动物试验的结果进行判定，结果与 5.2-.,.及第 6 章规定的情况相符时作出阳性报告，不符合者作出阴性报告。8 血清群和血清型鉴定有两种血清学试验，作为有条件实验室选做项 目，以进行更精确的细菌学鉴定。试验程序见N Y/T 5 6 4 2 0 0 2中第 4 章N Y/T 5 6
8、7-2 0 0 2 附录A(规范性附录)培 养基的配制A.，马丁琼脂制备方法 牛1 J 汤5 0 0 m 猪胃消化液5 0 0 m l.琼脂2 0 g 一2 5 gA.1.1 牛肉汤A 门.1.1 成分 牛肉5 0 0 g 水1 0 0 0 mlA 门.1.2 制法 将除去脂肪、筋膜的牛肉，用绞肉机绞碎，按上述比例混合、搅拌均匀 盛放于不锈钢锅，加温至6 5 C-7 5 C.保持4 5 m i n，继续加热至煮沸，保待 1 h 全过程中均应不断搅拌。煮沸完成后。捞出肉渣，沉淀 3 0 mi n，取上清液经白棉布过滤.将滤过的肉汤与从肉渣中压榨出的肉汤混合使用。A 门.2 猪胃消化液A.1.2.
9、1 成分 猪胃3 0 0 9 盐酸(H C U(化学纯，密度1.1 8 g/m I)1 0 m l 水1 0 0 0 m lA 门.2.p 制法 将除去脂肪的猪胃用绞肉机绞碎 按上述比例加人 6 5 Y 温水混合均匀，再加人盐酸，使 p H为 1.6-?.0，保持消化液5 1 C-5 5 C消化1 8h 2 4h 在消化过程的前 1 2 h至少搅拌 6-1。次 然后静置。以利胃组织溶解。液体澄清为消化完全与否的标志，如消化不完全，可酌情延长消化时间。除去脂肪和浮物，抽取清液煮沸3 mi n -5 m i n，放缸内静置沉淀4 8 I:再使用或加 2 m o l/I氢氧化钠(N a(川)调至P
10、I N.。左右，经灭菌贮存备用即可。按A.1.1 和A.1.2 按比 例混合，加琼脂后(除琼脂粉外，使用其他琼脂时须以流水充分冲洗并拧十)，加热溶解 待琼脂完全溶化后，以2 m o l/I氢氧化钠(N a O H)溶液调整p H为7.4 一7.6 0 以凝固沉淀法除去沉淀。分装于中性玻璃瓶中，以6 8.9 4 k P a 高压灭菌3 0 m i n 灭菌完毕，立即测定 p H，应为 7.2-7.6 根据需要，以无菌操作将健康无菌牛血清4%，加人到冷至S O Y 左子 I 的琼脂中，充分混合后，分装于平皿中，即为含 4%血清马丁琼脂平皿。经3 7 C 培养2 4 h-4 8 h，应无菌生长。N Y/T 5 6 7-2 0 0 2A.2 马丁 肉汤制备方法 午k汤(见 A.1.1)1 份 猪胃消化液(见A.1.2)1 份 将上述材料混合后，用2,mo l/L氢氧化钠(N a O H)溶液调p H为7.4-7.6，以6 8.9 k P a 高压灭菌3 0 m i n 或按需用量分装小瓶或试管后再以6 8.9 4 k P a 高压灭菌3 0 m i n，即为马丁肉汤。经 3 7 C培养 2 4 h-4 8 h，应无菌生长。