1、I C S 1 1.2 2 0B 4 1中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 4 4-2 0 0 2猪流行性腹泻诊断技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r p o r c i n e e p i d e mi c d i a r r h o e a2 0 0 2 一 0 8 一 2 7 发布2 0 0 2 一 1 2 一 0 1 实施中 华 人 民共 和 国农 业 部发 布3 5 5N Y/r 5 4 4-2 0 0 2前言 猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一，症状与猪传染性胃肠炎相似，病毒形态上也基本相同，但两
2、者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录 本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。本标准主要起草人:马思奇、王明、宣华、冯力、终有恩。N Y/T 5 4 4-2 0 0 2猪流行性腹泻诊断技术1 范 围 本标准规定了猪流行性腹泻(P E D)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(E L I S A),检测抗体的血清中和试验、间接E L I S A试验技术。本标准适用于对猪流行性腹泻
3、的诊断、产地检疫及流行病学调查等。2 病毒分离与鉴定2.1 材料准备2.1.1 器材 倒置显微镜，冷冻离心机，微孔滤器，细胞培养瓶，盖玻片，温箱等。2.1.2 培养基及溶液的配制 磷酸盐缓冲液(P B S)、细胞培养液、病毒培养液及N-2-经乙基呢嗓-N -2 一 乙烷磺酸(H E P E S)液(配制方法见附录A),2.1.3 细胞 V e r o 细胞系。2.2 病毒分离22-1 病料采集 采病仔猪空肠内 容物及小肠内 容物用于分离病毒，样品冷冻保存。2.2.2 病料处理 将采集的小段空肠连同 肠内容物用含1 0 0 0 I U/m L 青霉素,1 0 0 0 W g/m L 链霉素,P
4、B S 液制成5 倍悬液，在4 条件下 3 0 0 0 r/m i n离心3 0 m i n，取上清液，经 0.2 2 p m徽孔滤膜过滤，分装，一2 0 保存备用2.2.3 接种及观察 将过滤液(病毒培养液的1 0%)接种于V e r。细胞单层上，同时加过滤液量5 0%的病毒培养液，3 7 C吸附I h，根据组织堵养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置3 7 培养，逐日 观察 3 d-4 d，按致细胞病变作用(C P E)变化情况，可盲传 2 代一3 代。2.3 结果判定 C P E变化的特点是:细胞面粗糙，颗粒增多，有多核细胞(7 个8 个甚至几十个，并可见空斑样小区，细胞逐渐脱落，这是
5、特征性的C P E，可与(猪)传染性胃肠炎(T G E)病毒的C P E相区别。同时在细胞培养瓶中加盖玻片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中电镜观察可见到冠状病毒粒子。3 直接荧光抗体法3.13.1.13.1.23.1.3材料准备 器材:荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。荧光抗体(F A),溶液配制:磷酸盐缓冲液(P B S),0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘 油(配制方法见附录B)N Y/r 5 4 4-2 0 0 23.2 操作方法3.2.1 标本片的制备3.2.1.1 组织标本 采急性期内(5 d-7 d)患猪空肠中段的粘膜上
6、皮做涂片或肠段做冷冻切片(4 p m-7 p m)，丙酮中固定 1 0 mi n，置P B S中浸泡1 0 m i n-1 5 m i n，风干或自 然干燥。3.2.1.2 细胞培养盖玻片 将分离毒细胞培养 2 4 h-4 8 h的盖玻片及阳性、阴性对照片在P B S中冲洗数次，放人丙酮中固定1 0 m i n，再置于P B S中浸泡 1 0 mi n-1 5 mi n，风干。3.2.2 F A染色3.2.2.1 用0.0 2 伊文思蓝溶液将F A稀释至工作浓度(1:8 以上合格)。12.2.2 4 0 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n，取上清液滴于标本上。3.2.2.3 3 7
7、 C 恒温恒湿染色 3 0 m i n，用P B S冲洗 3 次，依次为3 m i n,4 m i n,5 m i n，风干，滴加磷酸盐缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。3.2.3 结果判定 判定标准:在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应完整清晰。并在阳性、阴性对照均成立时判定。在胞浆中见到特异性苹果绿色荧光判定为阳性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。可根据细胞内荧光亮度强、弱分别作如下记录:a)+:呈闪亮苹果绿色荧光;b)+:呈明亮苹果绿色荧光;c)+:呈一般苹果绿色荧光;d)+:呈较弱绿色荧光;e)一:呈红色。结果为a)-d)者均判为阳性。4 双抗体夹心E L I S A4.
8、1 材料准备4.1.1 器材:定量加液器、微量移液器及配套吸头、9 6 孔或4 0 孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪。4.1.2 猪抗P E D-I g G及猪抗P E D-I g G-H R P(H R P 为辣根过氧化物酶)。4.1.3 溶液配制:洗液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液 配制方法见附录C a4.1.4 待检样品:发病仔猪粪便或肠内容物，用浓盐水1,5 稀释，3 0 0 0 r/m i n 离心2 0 m i n，取上清液待检。4.2 操作方法4.2.，冲洗包被板 向各孔注人无离子水，浸泡3 m i n 甩干，重复3 次，甩干孔内残液，在滤纸上吸干。4.
9、2.2 包被抗体 用包被稀释液稀释猪抗P E D-坛 G至使用倍数，每孔加1 0 0 p L,置4 过夜，弃液，用洗液冲洗3 次;每次3 m i n,4.2.3 加样品 将被检样品用样品稀释液(见第C.3 章)做5 倍稀释，加人两孔，每孔 1 0 0 p L，每块反应板设阴性抗原、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置3 7 作用 2 h，弃样品，冲洗同4.2.2,4.2.4 加酶标记抗体 每孔加1 0 0 叮 经酶标抗体稀释液稀释至使用浓度的猪抗P E D-I g G-H R P,置3 7 C 2 h，弃液，冲洗N Y/T 5 4 4-2 0 0 2同4.2.2.4.2.5 加底物溶液 每孔加新配制
10、的底物溶液1 0 0 p L,置3 7 C 3 0 m i n.4.2-6 终止反应 每孔加终止液5 0 v L，置室温1 5 m i n,4.3 结果判定 用酶标测试仪在波长4 9 2 n m下测定吸光度(O D)值。阳性抗原对照两孔平均O D值0 1 8,阴性抗原对照两孔平均O D值(0.2 为正常反应，按以下两个条件判定结果:P/N值)2，且被检抗原两孔平均O D值)0.2 判为阳性，否则为阴性。注:P为阳性孔的O D值，N为阴性对照孔的O D值5 血清中和试验5.1 材料准备5.1.1 器材:微量移液器及配套吸头，9 6 孔微量平底反应板，二氧化碳培养箱或温箱，倒置显微镜，微量振荡器及
11、小培养瓶等。5.1.2 细胞:V e r o细胞系。5.1.3 病毒抗原和标准阴、阳性血清。5.1.4 指示毒毒价测定后立即小量分装，一3 0 冻存，避免反复冻融，使用剂量为 5 0 0 T C I D,o-1 0 0 0T C I D.,o,5.1.5 样品:同头份的健康(或病初)血清和康复三周后的双份被检血清在同条件下侧定，单份血清也可以进行检测。5.t6 溶液配制抗体效价:稀释液、细胞培养液、病毒培养液、H E P E S 液。5.2 操作方法5.2.1 用稀释液倍比 稀释血清，每份血清加4 孔，每孔5 0 p L，再分别加5 0 k I，指示毒。5.2.2 经微量振荡器振荡 1 mi
12、n-2 mi n，置3 7 C 中和 1 h,5.2.3 每孔加细胞悬液1 0 0 V L(2 0 万3 0 万个细胞/m L)，微量板置3 7 二氧化碳培养箱或用胶带封口置3 7 C温箱培养，7 2 h-9 6 h 判定结果.5.2.4 设阴、阳 性对照，病毒对照和细胞对照，阴性血清与待检血清同倍稀释，阳性血清做2-s 稀释。5.3 结果判定 当病毒抗原及阴性血清对照组均出现C P E，阳 性血清及细胞对照组均无C P E时，试验成立。以能抑制5 0%以上细胞出现C P E的血清最高稀释度的倒数判定为该血清P E D抗体效价的滴度。血清中和抗体效价 1:8 以上为阳性反应;1;4 为疑似反应
13、;小于1，4 为阴性反应，疑似血清复检一次，仍为可疑时，则判为阴性。v病后二周以 卜 的康复血清滴度是健康(或病初)血清滴度的 4 倍或以上判为阳性反应。6 间接 E L I S A6.16.1.1仪等6.1.26.1.3材料准备 仪器设备:定量加液器，微量移液器及配套吸头，9 6 孔或 4 0 孔聚乙烯微量反应板，酶标测试抗原和酶标抗体。溶液配制:磷酸盐缓冲液，包被稀释液，样品稀释液，酶标抗体稀释液，底物溶液及终止液。N Y/T 5 4 4-2 0 0 26.2 操作方法6.2 门冲洗包被板 向各孔注人无离子水，浸泡 3 mi n，甩干，重复 3 次，甩干孔内残液，在滤纸上吸干。6.2.2
14、抗原包被 用包被稀释液稀释抗原至使用浓度，包被量为每孔 1 0 0 ,L,置4 C冰箱湿盒内过夜，弃掉包被液，用洗液冲洗3 次，每次3 m i n.6.2.3 加被检及对照血清 将每份被检血清样品用血清稀释液做1:1 0 0 稀释，加入两个孔，每孔1 0 0 p L。每块反应板设阳性、阴性血清及稀释液对照各两孔，每孔1 0 0 p L盖好包被板置3 7 0C 湿盒内1 h，冲洗同6.2.2 e6.2.4 加酶标抗体 用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释至使用浓度，每孔加1 0 0 t L,置3 7 C 湿盒内1 h，冲洗同6.2.2 06-2.5 加底物溶液 每孔加新配制的底物溶液1 0 0 p L
15、在室温下避光反应5 m i n-1 0 m i n.6.2.6 终止反应 每孔加终止剂5 0 r L.6.3 结果判定6.3.1 目测法 阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判抗体阳性。6.3.2 比色法 用酶标测试仪，在波长4 9 2 n m下，测定各孔O D值，阳性对照血清的两孔平均O D值。.6，阴性对照血清的两孔平均O D值(0.1 6 2 为正常反应，O D值)0.2 0 0 为阳性;O D值。.2 0 0-0.4 0 0 时判为“十;0.4 0 0-0.8 0。判为“+;O D值0.8 0 0 判为“+十+;O D值在 0.1 6 3 0
16、.2 0 0 之间为疑似;0 1 值0.1 6 3 为“一”，对疑似样品可复检一次，复检结果如仍为疑似范围，则看P/N比值，P/N比 值)2 判为阳性,P/N 比值2 者判为阴性。N Y/T 5 4 4-2 0 0 2 附录A(规范性附录)溶 液 的 配 制A-1 0.0 2 m o l/L p H 7.2 磷酸盐缓冲液(P B S)的配制A.，.飞 0.2 m o l/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H,0)7 1-6 4 g，先加适量无离子水溶解，最后定容至1。m L,混匀。A.1.2 0.2 m o l/L磷酸二氢钠溶液:称取磷酸二氢钠(N a H i P O,2 H,0)3 1.2 1 g，先加适量无离子水溶解，最后定容至1 0 0 0 m L,混匀。A.1.3 量取 0.2 m L/L磷酸氢二钠溶液 3 6 0 m L,0.2 m o l/L磷酸二氢钠溶液 1 4 0 m L，称取抓化钠3 8 g，用无离子水溶解稀释至5 0 0 0 m L,4 保存。A.2 细胞培养液的配制 含1 0%灭活犊牛血清的1 6 4 0 营养液，加1 0 0 I U/