1、IC sB 4 11 1.2 2 0中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 6 3-2 0 0 2禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r f o w l c h o l e r a(a v i a n p a s t e u r e l l o s i s)2 0 0 2 一 0 8 一 2 7发布2 0 0 2 一 1 2 一 0 1实施中 华 人 民 共 和 国 农 业 部发 布5 o sN Y/r 5 6 3-2 0 0 2前言 禽崔乱(f o w l c h o l e r a)
2、又名禽巴氏杆菌病(a v i a n p a s t e u r e l t o s i s).是由多杀性巴氏杆菌引起的家畜和野禽的接触传染性疫病 本病呈现急性败血症变化，其发病率和死亡率很高.对养禽业危害严市 被li t界动物 以 l 组织仁 Wo r l d O r g a n i z a t i o n f o r A n i m a l H e a l t h(英),O f f i c e I n t。了:i o n a l d e s E p i z o o t i c(法)，O I E 定为”类动物疫病，我国列为几类动物疫病。术标准在主要诊断技术方面与O I E 诊断试验和疫苗手册
3、)(2 0 0 0年版)第2.-1.I 1 条的规定是一致的。但也有以 卜 左异:O I I;(手 册)Z.7.1 1 条对具体操作程序未作详细描述，本标准则根据实践经验规定了具体操作 程序;本标准末完全采用其他推荐性技术 本标准的附录 A、附录 B为规范性附录。本标准山农业部畜牧兽医局提出。本标准由个I ij 动物检疫标准化委员会归口。本标准起i;Y:单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 本标准主要起草人:曲连东、吴东来。N v/T 5 6 3一 2 0 0 2禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术范围本标准规定 J禽霍乱的诊断技术要求本标准适用于鸡、鸭、鹅等禽霖乱的诊断和检疫2 规范性引用文件 下
4、列文件中的条款通过本标准的引片 1 而成为本标准的条款 凡是注 期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而 鼓励根据卞标准达成协议的各方研究是否可 使川这此文件的最新版本 凡是不注日 期的引用文件 其最新版本 适川十 本标准 G R 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 食品卫生微生物学检验染色法、培养鹅和试刹3 初步诊断 根据典J U 症状和病变，以及在显微镜下检查组织涂片发现的两极染色的杆菌.o f 初步诊断本病但确诊应依靠病原分离鉴定。3.1 症状3.1.1 急性型症状 最初出现禽群 ，些禽只突然死亡 随后即出现另外禽只发热、火食、抑郁、流诞、腹
5、泻、羽毛粗乱、呼吸困难，临死前出现发组3.1.2 慢性症状 急性型耐过的或由弱毒菌株感染的禽只可呈慢性I病程.i t 特拟为局部感染，在关竹、趾垫、腿鞘、胸什粘液囊、眼结膜、肉垂、喉肺、气囊、中耳、骨髓、脑膜等部位呈现纤维素性化脓性渗出、坏死或不同程度的纤维化3.2 病理变化 急性I M的病变主要是被动性充血、出血，肝、脾肿大和局灶性坏死，肺炎、腹腔和心包液增多。慢性刑t:要是局灶部纤维素化脓性渗出、坏死和纤维化3.3 病料涂片检菌3.3 门抹片的制备 1 月 镊 f 夹待病变组织肝或脾.然后以灭菌剪刀剪取小块，夹出后将其新鲜切面在载玻片卜 压印或涂抹成薄层;若取血液，用灭菌剪)I 剪开心脏进
6、行蘸取或剪取凝血块、用新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层3.3.2 千燥 自然 卜 燥3.3.3 固定 将 于 燥好的抹片，涂抹而向上，以其背面在酒精火焰上来回通过数次 略作加热进行固定13.4 革兰氏染色法 固定好的抹片 飞 滴加草酸铰结晶紫色液，染色 2 mi n 水洗、加苹 介 氏碘溶液于抹片 卜 媒染 2 mi n，水洗 卜 加9 5 g洒精于抹片 卜 脱色 1 m i n-，水洗，加稀释碳酸复红复染”、，水洗，吸 f，镜检。本N Y/e 5 6 3-2 0 0 2病原体为革 兰氏阴 性球杆菌或短杆菌，菌体大小为。.2 p m-0.4 p t mX 0.6 j-一 .5 h m，单个或
7、成对存在，常有英膜3.3.5 其他染色法 甲醇固定.按G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中2.6 或2.1 规定进行，瑞特氏或美蓝染色呈两极浓染的菌体4 病原分离和鉴定4.，病原分离4.1.1 病料的采集4.1.11 最急性和急性病例可采集死亡禽只的肝、脾、心血;慢性病例一般采集局部病灶组织;对不新鲜或已被污染的样品，可自骨髓中采取病料。采病料时用烧红的刀片烧烙组织，而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插人组织或心血内取样4 门.1.2 如果为活禽，可通过鼻孔挤出粘液.或将棉拭子插人鼻裂中取样4.1.2 培养基制备 5 写鸡血清葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基.配制方法见附录 A,4
8、.1.3 动物接种 如果病料污染严重，则可将。.Z ml碾碎的病料，经皮下 或腹腔内接种家兔、小鼠或易感鸡，接种动物在2 4 h-4 8 h 内死亡 可以从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌4.了.4 培养 将病料接种十 5%鸡血清的葡萄糖淀粉琼脂(见第 A.1章)、鲜血琼脂培养基(见第 A.2章)在3 5 一3 7 C下 培养，经 1 8 h-2 4 h培养后菌落直径为 1 m。一3 m m 菌落呈散在、圆形，表面凸起呈奶滴状 4.2 病原鉴定4.2.1 培养特性 为兼性厌气菌，仁长最适温度为3 5 C-3 7(经 1 8 h-2 4 h培养后，菌落白 _ 径为1 mm-3 mm,呈散在的圆形
9、凸起和奶油状.有英膜菌落稍大4，2.2 镜检 从菌落上挑取少量涂片，干燥，固定、染色、镜检同3.3.2 -3.3.54.2.3 生化鉴定 鉴定方法如下 a)接种于葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖和甘露醇发酵管产酸而不产气.接种于鼠李糖、戊醛糖、纤维 二掂、绵子糖、菊搪、赤奔糖、戊 五醇,M一 肌醇、水杨 甘发醉管 不发酵。糖发酵管按 Gl 3 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4,/1 3.2 规定配制。1,)接种丁蛋自陈水培养基中，可产生叫垛。试验按G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中3.1 3 规定的方法操作 c)鲜血液琼脂上 不产生溶血。操作方法按G B 4 7 8 9.2 8-
10、1 9 9 4 中4.6 规定进行 d)麦康凯琼脂 卜 不生长。麦康凯琼脂按G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中4.2 4 规定配制 。)能产ff过氧化氢酶(方法按 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中 3.2。规定进行)、氧化 酶(方法按 G B 4 7 8 9.2 8 1 9 9 4 中 3.1 8 规定进行).但不能产生尿素酶(方法按G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中 3.1 5 规定进行).(3半乳糖普酶(方法按GB 4 7 8 9.2 8一 1 9 9 4中3.3 规定进行)。f)维培(V I I)试验为阴性。试验按 G B 4 7 8 9.2
11、8-1 9 9 9中 3.4 规定力法进行4.2.4 动物接种试验 细菌纯培养物稀释后.以1 0。个细菌经皮下或腹腔内接种家兔、小鼠或易感鸡，接种动物在 2 4 h-4 8 h内死亡，并可以从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌。4.3 结果判定N Y/r 5 6 3-2 0 0 2依据病原分离培养特性、生化鉴定、动物接种试验可作出确切诊断5 琼脂扩散试验(用于监测免疫效果和追溯性诊断)5 门材料准备5.1.1 禽霍乱琼脂扩散抗原、标准阳性血清和标准阴性血清。按说明朽 使用5.1.2 溶液配制:1%硫柳汞溶液、p H6.4 的0.0 1 m o l/I磷酸盐缓冲(P B S)溶液和生理盐水、配制方
12、法见附录“5.1.3 琼脂板的制备:取!H 6.4 的0.0 1 m o l/l.P B S 溶液1 0 0 n il 放r=:角瓶中，加人().8 g-1.0 g 琼脂糖.R g 氯化钠二角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖等熔化.再加 1 硫柳求飞 m l冷至4 5 C-5 0 C 时，将洁净1 二 热灭菌直径为9 0 m m的平皿置于平台上 辱个平皿加人1 8 ml 一，n il加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发。放普通冰箱中保存备用(时间不超过 2 周).5.2 操作方法5.2.1 打孔 在制备的琼脂板 仁用直径4 m。的打孔器按六角形图案打孔 或川梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔即离为 3 m
13、m。将孔中的琼脂用 8号乍 头斜面向 上 从右侧边缘插人，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘，避免琼脂层脱离平皿底部5.2.2 封底 用酒精灯轻烤平皿底部到琼脂微熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏、5.2.3 加样 用微量移液器吸取用灭菌生理盐水(见第B.3 章)稀释的抗原悬液滴人中间孔 标准阳性血清分别加人外周的 1,4 孔中，标准阴性血清(每批样品仅做一次)和受检血清按顺序分别加人外周的 2,3,5,6孔中。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。5.2.4 感作 加样完毕后，静止5 mi n-1 0 mi n，将平皿轻轻倒置.放人湿盒内置 1 7 C 温箱中反应，分别在2 4 h
14、和4 8 h观察结果5.3 结果判定5.3.1 判定方法 将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现 一 条清晰的白色沉淀线 标准阴性血清 与抗原孔之间不出沉淀线，则试验可成立5.3.2 判定标准5.3.2 门若被检血清孔与中心孔之间出现清晰沉淀线，并与阳性血清孔与中心孔之间沉淀线的末端相吻合 则被检血清判为阳性5.3.22 若被检血清孔与中心孔之问不出现沉淀线，但阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线一端在被检血清孔处向抗原孔方向弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性，应重复试验.如仍为可疑，则判为阳性5.3.2.3 若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线.阳性血清孔。中心孔之Ih l 的
15、沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性5.3.2.4 若被检血清孔 J 中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊和标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线交叉并tY 伸，待检血清孔为非特异性反应，应重复试验 若仍出现i 卜 特异川反应则判为阴性 判阳性者视为禽体内存在禽霍乱抗体N Y/T 5 6 3-2 0 0 2 附录A(规范性附录)培养基的配制A.1 5 写鸡血清葡萄糖淀粉琼脂培养基制备n il _m L晰l(j 粉养琼脂(按GB 4 7 8 9.2 8 3%淀粉溶液 葡萄糖 鸡血7 i f 将灭菌的营养琼脂加热熔化平板A.2 鲜血琼脂培养基制备1 9，4，卜4.7 规定配制)jO g5 n il,使冷却
16、到 J O C，加人火菌的淀粉溶液、葡萄糖及鸡血清 混匀后，倾注肉及液肉汤(按 GB 4 7 8 9.2 8蛋1,1 1 11磷酸氢 几 钾(KHP(),氯化钠C Na C I)琼脂灭菌加热熔化，使冷却到 5 0 C1 9 9 4中4.1 规定配制)1 0 0()n il 1 0 g 1.()只 5g 2 59加人无菌鸡鲜血达1 0%,混匀后，倾i t 平板;1 qN v/r 5 6 3一 2 0 0 2 附录B(规范性附录)溶 液 配 制B 门1%硫柳汞溶液的配制硫柳 求蒸馏水溶解后，存放备用).1g1 0 0 m lB.2 p H6.4的0.0 1 m o l/L P B S溶液的配制甲液:3.5 8 g磷酸氛二钠(N a _ H P O,.1 2 H,O)加蒸馏水至1 0 0 0 ml乙液:1.3 6 g磷酸二氢钾(K H _ P O,)力 11 蒸馏水至1 0 0 0 ml待溶解后分别保存I 1 时取甲液2 4 n il、乙液7 6 m l混合即为1 0 0 ml.p H6.4 的().0 1 m o t/L P B S溶液。B.3 生理盐水的配制氯化钠(N a C l)蒸馏水