1、中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验47 89.1 3 一 9 4GB储产 气 英 膜 梭 菌 检 验GB 4 7 8 9.1 3一8 4Mi c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f f o o d h y g i e n e E x a mi n a t i o n o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e u s1 主题内容与适用范围 本标准规定了产气英膜梭菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中产气英膜梭菌的检验。2 引用标准 G
2、B 4 7 8 9.2 8 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂3 设备和材料3.1 均质器。3.2 显微镜。3.3 温箱:3 6 士1 C。3.4 水浴。I5 厌氧培养装置:常温催化除氧式或碱性焦性没石子酸除氧式。3.6 吸管:1 m L,1 0 m L e3.了 试管。3.8 平皿。3.9 接种环或接种针。4 培养墓和试荆:.;厄肉培养基:G B 4 7 8 9.2 8 中4.6 7.亚硫酸盐一 多粘菌素一 磺胺啼吮琼脂(S P S):G B 4 7 8 9.2 8 中4.6 9,液体硫乙醇酸盐培养基(F T):G B 4 7 8 9.2 8 中4.7 0,动力一 硝酸盐培养基:G
3、B 4 7 8 9.2 8 中4.7 2,含铁牛奶培养基:G B 4 7 8 9.2 8 中4.7 1,卵黄琼脂培养基:G B 4 7 8 9.2 8 中4.6 8,0.1%蛋白陈水稀释剂:G B 4 7 8 9.2 8中4.8 6,硝酸盐还原试剂:G B 4 7 8 9.2 8 中3.1 7,革兰氏染色液:G B 4 7 8 9.2 8 中2.2.月.弓几J月弓亡JU1 奋.-月月q月马月q月q月q口.中华人民共和国卫生部1 9 9 4 一 0 3 一 1 8 批准1 9 9 4 一 0 9 一 0 1 实施G B 4 7 8 9.1 3 一 45 检验程序产气英膜梭菌检验程序如下:检样2
4、5 g(.L)检祥+2 2 5.L 0.1%蛋白膝水稀释剂均质、离心、稀释 l o-,稀释液 +S PS琼脂很合倾注 l o-,稀释液 +S P S琼脂混合倾注 1 0稀释液 +S PS琼脂混合倾注 l o-,稀释液 +S PS琼脂混合倾注 1 0 一猫释液 +S P S琼脂棍合倾注厌氧培养,3 6 士1 C,2 4 h,黑色菌落计数任挑黑色菌落1 0 个，分别接种F T 培养基确证试验债检形态硝酸盆还原牛奶发醉卵碑脂分解菌数计算6 操作步驻6.1 活菌计数培养6.1.1 按无菌操作称取食品检样 2 5 g(m L)放入均质器，加0.1%蛋白陈水稀释剂2 2 5 m l，低速搅动1 -2 m
5、i n，使之均质化，作为1:1 0 稀释液。6.1.2 以上述1:1 0 稀释的均质液按 1 m L加0.1%蛋白陈稀释剂9 m L做成 1 0-1 -1 0 一的系列稀释液。6.1.3 吸取各稀释液1 m L分别放人2 个灭菌平皿内。每个平皿浇注约5 0 的S P S 琼脂1 5 2 0 m 1，仔细转动平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。6.1.4 上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内，于3 6 士1 培养2 4 h,2 0 8G B 4 7 8 9.1 3 一9 46.1.5 选取长有3 0 -3 0 0 个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。6.2 确证试验6.2.1 由 平板上任取1 0
6、个黑色菌落，分别按种F T培养基，于3 6 士1 培养1 8 -2 4 h,6.2.2 用上述培养液徐片，革兰氏 染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳 性粗大杆菌，其耐热株可能形成卵形芽抱，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。6.2.3 用接种环(针)穿刺接种动力一 硝酸盐培养基，于3 6 11 培养2 4 h，观察接种线的生长情况，判断有无 动力。然后，滴加甲 蔡 胺液和对氨基苯 磺酸液各0.5 m L,观察硝酸盐是否 被还原。产气英膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。6.2.4 取生长旺盛的F T培养液1 m L接种于含铁牛乳培养基，在4 6 水浴中培养2 h 后观察有无“暴烈发酵”
7、现象，5 h内不发酵者为阴性。产气英膜梭菌发酵乳搪，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。6.2.5 用接种环取F T培养液点种于卵黄琼脂平板(每张平板至少可接种1 0 点)，于3 6 士1 厌氧培养2 4 h，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围 形成乳白色的混浊带。6.3 菌数计算 根据黑色菌落的计数(6.1.5)和确证试验的结果(6.2)，计算每克(毫升)食品检样的含菌数。例如:1 0-稀释液的平板长有黑色菌落 1 0 0 个，而供做确证试验的1 0 个菌落中有7 个被确证为产气英膜梭菌，则每克(毫升)食品 检样所含产气英膜梭菌数为:1 0 0只 0.7 X 1 0 =7X 1 0 附加说明:本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由 卫生部兰州生物制品研究所负责起草。本标准主要起草人王成怀。本标准由卫生部委托技术归口 单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。