1、【GB 170131997】包虫病诊断标准及处理原则 包虫病诊断标准及处理原则 前 言 包虫病又称棘球蚴病，是棘球绦虫的幼虫寄生在人体内引起的疾病。在我国有两种，即细粒棘球蚴引起的囊型包虫病和由多房棘球蚴引起的泡型包虫病。我国已有 22 个省（市）、自治区存在当地感染的囊型包虫病人。泡型包虫病在宁夏、新疆、甘肃、四川、青海、西藏和黑龙江有病例报告。包虫病是我国北方和西南地区危害人畜的重要寄生虫病，属法定丙类传染病。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准负责起草单位：卫生部包虫病防治培训基地（新疆地方病防治研究所）；参加起草单位：新疆维吾尔自治区人民医院、中国预防医学科学院寄生虫病研究所。本标
2、准主要起草人：柴君杰、谭家忠、薛海筹。本标准由中华人民共和国卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院负责解释。1 范围 本标准规定了囊型包虫病和泡型包虫病的诊断及处理原则。适用于各级、各类医疗保健、卫生防疫和地方病防治机构对两型包虫病的诊断和处理。2 定义 21 囊型包虫病cystic hydatid disease（CHD），cystic echinococcosis（CE）由于细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）的幼虫寄生而引起的疾病。22 泡型包虫病alveolar hydatid disease（AHD），alveolar echinococcosis（AE）
3、由于多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）的幼虫寄生而引起的疾病。3 诊断标准 31 流行病学史 流行地区的居住史或旅游史，豢养或接触过家犬。有野外工作和猎狐史；接触过狐狸尸体、皮张等。32 临床表现 321 囊型包虫病：早期可无任何症状，往往在影象检查中发现。肝囊型包虫病有肝区隐痛、上腹饱胀感、消化不良、消瘦、贫血。肝大，上腹部包块。肺囊型包虫病有胸部隐痛、刺痛、胸闷、咳嗽、气短、咯血，有时随痰咳出粉皮样内囊碎片或子囊，或在痰液检查时发现原头节的头钩。其他脏器包虫病具有该脏器占位性疾病之特有症状。322 泡型包虫病：肝大、肝区隐痛。晚期肝功能损害，脾肿大、肝脏
4、可触及硬结节、黄疸，消瘦、衰竭。发生转移时出现转移病灶所在脏器产生的症状。33 影象检查 影象学特征在包虫病的诊断上有重大价值。肝包虫病以B超扫描为主要手段，肺包虫病以X线检查为主，各有特征性影象。为了鉴别诊断或有特殊需要时，可做CT检查（详见附录B）。34 实验室检查（详见附录A）341 检测血清中特异性抗体（用IHA、ELISA、EITB等方法）。342 检测血清中特异性循环抗原或免疫复合物。343 痰液和咳出物的寄生虫学检查。344 临床标本的病理组织学检查。35 临床诊断 具备流行病学史、主要临床症状或体征、影象学特征或血清中检出特异性抗体者。36 确定诊断 除具备临床诊断的依据外，还
5、具有下列条件之一者。361 血清中反复检出特异性循环抗原或免疫复合物。362 咳出囊膜、子囊或痰中检出头钩。363 临床活检材料病理组织学检查证实。364 手术探查证实为包虫囊。4 处理原则 41 手术治疗 411 囊型包虫病手术方式 4111 内囊穿刺摘除。4112 内囊完整摘除。4113 包虫完全切除（肝叶切除）。4114 肝、肺外囊残腔的合理处理。412 泡型包虫病手术方式 4121 根治性切除。4122 姑息性切除。4123 姑息性清除引流。42 药物治疗 421 药物和疗程 阿苯达唑为首选药物，以采用小剂量（10mgkg）长疗程或多疗程反复治疗的方法较好。泡型包虫病人应以药物治疗为主
6、。对于晚期病人疗程可达 35 年，甚至终生维持治疗。422 适应证 4221 囊型包虫病。4221.1 继发性腹腔、胸腔包虫病。42212 多脏器、多发囊或多次手术后复发的包虫病人。42213 早期发现的包虫病人。42214 不宜手术或拒绝手术者。4222 泡型包虫病：不论手术与否均应进行药物治疗，包括晚期病人，肺、脑转移者。4223 手术前后病人进行 23 个疗程有控制术中原头节移植和防止复发的作用。423 禁忌证 肝、肾功能不全和孕妇禁用。5 预防 51 实行家犬管理和吡喹酮驱虫。52 开展预防包虫病的健康教育。53 严格实行屠宰管理，妥善处理感染牲畜的脏器。54 在泡型包虫病高发区开展控
7、制狐狸传播本病的措施。55 在高流行区人群中进行普查、早期发现病人给予治疗。附录 A （标准的附录）免疫学诊断方法 A1 间接红细胞凝集试验（IHA）A11 抗原制备 用 25戊二醛醛化的绵羊红细胞，经终浓度 120000鞣酸处理后，以最适浓度的囊液粗抗原或纯化的抗原致敏。致敏后的红细胞以含 10蔗糖及 1正常兔血清的pH72PBS配成 5悬液分装安瓿（1mL支），置 4冰箱保存或冻干封存（02mL支）。使用浓度为 1。A12 操作方法 A1.21 准备抗原：如为冻干产品，则加入 1mL蒸馏水稀释混匀备用。A122 用微量滴管滴加 1兔血清磷酸缓冲盐水于V型微量反应板上第一孔加 3 滴，其余各
8、孔均为 1 滴（25L）；至少做六孔。第一孔加待检血清 1 滴（25L）即血清稀释度为 14；混匀后从中吸取血清 1 滴加入第二孔；混匀，依次作倍比稀释；最后一孔混匀后吸弃 1 滴。并平行做阴性、阳性对照。A123 从第二孔起，每孔加入致敏红细胞悬液 1 滴（25L）；立即振摇 1min；加盖板，室温下静置 1h，观察结果。A13 结果判断 A131 阴性反应：红细胞全部沉入孔底呈点状，边缘光滑。A132 阳性反应：以血清 1128稀释出现阳性反应者（+或+）判为包虫血清抗体阳性。+红细胞形成薄层凝集，充满整个孔底或边缘有皱褶。+红细胞形成薄层凝集，面积较小，边缘松散。+红细胞大部分沉于孔底，
9、形成一圆点或圆圈，周边模糊或中心有白色小点。A2 酶联免疫吸附试验（ELISA）A21 抗原 包虫囊液纯化抗原（磷钨酸、氯化镁沉淀法制备）。A22 操作方法 A221 抗原包被聚苯乙烯板：用 005mo1LpH96 碳酸缓冲液稀释抗原至最适浓度，每凹孔加入 100L，置温盒。4过夜（或 1224h），次日，倾去抗原，用含 005吐温 20 磷酸缓冲盐水（001molL，pH74PBST）洗涤 3 次，每次 5min，甩干。A222 加待检血清：血清用PBST作 1200稀释，每凹孔加入 100L，每板应设参考阳性一孔，参考阴性三孔及PBS对照一孔。置温盒，371h，然后取出，倾去血清，洗涤同前
10、。A223 加结合物：加入用PBST作工作稀释度的辣根过氧化物酶（HRP）标记结合物 100L，37，1h倾去结合物，洗涤同前。A2 2 4 加底物：通常加邻苯二胺（OPD）底物溶液（10mg OPD25mL pH5 0 柠檬酸缓冲液30H2O210L）100L，37，30min。A225 加中止液：2molLH2SO450L。A23 结果判断 在酶标专用比色计上读取 492nm OD值，以待测样本（S）对阴性对照血清（N）的SN值21 为阳性临界值。A3 PVC薄膜快速ELISA A31 抗原 包虫囊液纯化抗原。A32 操作方法 A321 取已包被好抗原的PVC薄膜软板，编号，用PBS-T洗
11、一次，然后每孔加PBST200L；A322 加待检血清及参考血清（每板作阴性对照一孔、阳性对照一孔）每凹孔 10L，混匀，置湿盒 37 5min（或 25室温10min）。倾去血清，用PBST连续洗 8 次，甩干。A3 2 3 加酶结合物：按工作浓度稀释，每孔 200L，37 5min，倾去结合物，同上洗涤 8 次，再加蒸馏水洗一次，甩干。A3 2 4 加入底物溶液：含 3H2O2的TMB底物，每凹孔 200L，反应 510min（TMB底物溶液的制备：TMB50mg溶于 10mL二甲基亚砜中作为母液，4保存。用前取母液 1mLpH50 柠檬酸缓冲液50mL30H2O28L）。A33 结果判断
12、 按每批的阴性及阳性对照目视判断结果。阴性基本无色，阳性为鲜蓝色。A4 酶联免疫印渍技术（EITB）A41 抗原膜条制备 采用 520厚 075mm梯度胶，包虫囊液抗原按 1gmm加入，上槽缓冲液为 01molL硼酸缓冲液，下槽液为 0424molLpH918TrisHCl，抗原经SDSPAGE电泳分离后，再经转移电泳。转移电泳液为 0212molL pH918TrisHCL，含 20甲醇电泳 30min，即将分离的抗原蛋白带由凝胶转移到硝酸纤维膜上，此膜用PBST洗 3 次，PBS洗 1 次，每次 5min，然后将膜切成 3mm宽的长条，此为抗原膜条，夹于PBS湿滤纸中封于塑料袋，保存于冰箱
13、中备用，若存于低温冰箱，可长期保存。A42 操作方法 A421 试验时，将膜取出或解冻。先于反应槽中加入 495L含 5脱脂奶粉及 3吐温PBS，再加入 5L待检血清，最后加入抗原膜条，每批试验应设参考阳性、阴性和PBS对照。室温振摇 1h（4可过夜）。次日，用 03吐温PBS洗 4 次，每次 5min吸干。A422 加入工作浓度稀释的结合物，室温 1h，洗涤同前。A423 加入DABH2O2系统（25mg3，3二氨基联苯胺50mL无吐温PBS5LH2O2）显色 10min，自来水冲洗中止反应，晾干。A4 2 4 判读结果：目测特异性条带，以 60KD、36KD、32KD、24KD、20KD、
14、17KD和 12KD为阳性条带。其中只要出现 12KD、17KD、24KD条带即可判为阳性。A5 循环抗原检测 A51 将抗包虫单克隆抗体用 005molL pH96 碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板，每孔 100L，4过夜后用PBST洗板 3 次。A52 每孔加入含 10小牛血清的PBS-T 100L，于 37下封板 1h，洗板 3 次。A53 待检血清用上液稀释为 12，每孔加 100L，每份标本加两孔，37C温育 1h，洗板 3 次。A54 加入工作浓度的HRP标记单抗 100L 37 1h后，洗板 3次。A55 加入OPD底物溶液 100L，37 30min。A56 加入 2mol
15、LH2SO450L，终止反应。A57 测各孔OD490。A58 对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（510gmL抗原 100L），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值3SD为阳性临界值。A6 循环免疫复合物检测 A61 用 001molL pH84 硼酸盐缓冲液将PEG6000 配成7溶液，取此液 100L加等量 12待检血清混合置室温下 1h后，3000rmin离心 1h。A62 吸去上清液，在沉淀中加含有 8molL尿素的 005molL pH96 碳酸盐缓冲液 05mL，溶解沉淀物。A63 用此液包被酶标板每孔 100L，每份标本包被两孔，4过夜后，洗板 3 次（阳性及阴性对照同样处
16、理）。A64 每孔加含有 10小牛血清的PBST100L，37封板1h，洗板 3 次。A6 5 加入工作浓度HRP标记的抗包虫单克隆抗体 100L，37下 1h后洗板 3 次。A66 加OPD底物 100L，37下 30min。A67 加入 2molLH2SO450L终止反应。A68 测各孔OD490。A69 对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（同 68项），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值十 3SD为阳性临界值。A7 泡型包虫病特异性EITB技术 A71 抗原膜条制备及免疫印渍试验 A711 收取人工感染多房棘球蚴的长爪砂鼠腹腔中的包囊，剪碎后收集原头节，反复洗涤后，用去氧胆酸钠溶液溶解并抽提后，用PBS透析，收集抗原，测定蛋白质含量并调整至 2mgmL浓度。A71.2 用 12或 20浓度聚丙烯酰胺凝胶或 816梯度胶（厚 15mm）按常规进行SDSPAGE电泳。在长度为 6cm的胶上每一大孔加蛋白质 400g。电泳后按常规转移至硝酸纤维膜上（孔径0 45m）。然后切成膜条，进行免疫印渍试验。待检血清稀释 150。A72 结果解释：在分子量为 18KD位置出现酶免疫染色条带