1、中华人民共和国国家标准肉与肉制品四环素族U D C6 8 7.5 1;.5 2材 8.0 6抗生素残留量检 验GB 9 69 5.16 一 a sMe a t a n d m e a t p r o d u c t s-Me t h o d f o rt h e e x a mi n a t i o n o f t h e r e s i d u e s o f t e t r a c y c l i n e s1 主皿内容与适用范围 本标准规定了肉和肉制品中四 环素族抗生素残留量的检验方法。本标准适用于肉和肉制品中四 环紊族抗生素残留量的检验。2 引 用标准 G B 9 6 9 5.1 9
2、肉与肉制品 取样方法3 原理 四 环素族(四环素、土霉素、金霉素)抗生素具有很强的 抑菌作用。在接有特定微生物的平 板培养基上放人牛津 杯，在牛津杯内加满试样溶液，培养后测最抑菌圈的大小。4.1试剂 与培养基 试剂:4.1.1 磷酸盐缓冲液(p H 4.5)精确称取碑酸二氢钾(G B 1 2 7 4，分析纯)1 3.6 8,溶解于蒸馏水中，定容到l 0 0 0 m L,高压灭菌1 1 5 C,3 0 m i n，冷却 后置4 冰 箱内保 存。4.1.2 生理盐水称 取氮化钠(G B 1 2 6 6)8.5 9 溶解于1 0 0 0 m L 蒸 馏水中，高压灭菌1 1 5 0C,3 0 m i
3、n,4.1.8 盐酸(GB 6 2 2):O.I m o l/L 溶液。4.1.4 标准四环素原液:精确称取四环素5 0 m g，用。.l m o l/L 盐酸 1 m L 溶解，用水定容到1 0 0 0 m L，在4 冰箱中可保存一周。4.2 培养基:4.2.1 菌种培养基:胰蛋白 陈l 0.O g 牛肉 膏5.0 g 抓化钠(G B 1 2 6 6)2.5 g 琼脂1 4.0 一1 6.0 g 燕 馏水l 0 0 0 m L 将以 上成分加热 溶解，高压灭 菌1 2 1 0C 1 5 m i n，最终p H 6.5 1 0.1,4.2.2 检定用培养基:胰蛋白 陈6.0 g 牛肉膏1.5
4、9 酵母 膏3.0 g 琼脂1 4.0-1 6.0 g中华人民共和国商业部1 9.一0 2 一 2 5 批准1 9 8 9 一 0 3 一 0 1 实施Gs 9 6 9 5，i 6 一 I 7蒸馏水1 0 0 0 m L 将以上成分加 热 溶解，高 压灭菌1 2 1 C 1 5 m i n,最 终p H 5.8 士。.1,5 仪器和设备5.1 培养皿:内径9 0 m m，底部平整光 滑，具陶质盖。5.2 牛津杯:内径6 1 O.I m m，外径7.8 1 0.1-m,高 度1 0 1 0.1 m m.5.3 游标卡尺:测量抑菌圈直径用。与.4 均质器。石.6 离，L.、机。5.恒温水浴。5.了
5、 恒温培养箱。5 二 电 热于 烤箱1 7 0 1 0.1 0C,6 试样6.16.2按G B 9 6 9 5.1 9 取 样。至少取有代表性试样2 0 0 g，用绞肉机绞 2 次混匀，放在封闭容器中于冰箱内贮存备用，试样要尽快分析。7 分析步骤7.1 检样液的制备 称取试样1 0.0 g，加入。.I m o l/L 磷酸缓冲液2 0 m L 小心搅匀放置6 0 m i n,然 后于均质器中均质(3 0 0 0一6 0 0 0 r/m i n)1 m i n,经4 O O O r/m i n 离心I O m i n，其上清液为检样液。7.2 菌液和检定用平 板的制备7.2.1 菌液的制备 菌种
6、:蜡样芽抱杆菌(B a c c e r e u s A T C C 1 1 7 7 8)由卫生部药品生物制品检 定所提供。将菌种移种于盛 有3 0 0 m L 菌 种培养基的克氏 瓶中，于3 0 培养箱中 培养7 天。镜检 芽抱 数达 到8 5 0/o以上，用生理盐水2 5 m L 洗下菌谷，置6 5 C 恒温水浴中加 热3 0 m i n，离心(2 0 0 0 r/m i n)2 0 m i n，弃去上清液，如此重复洗涤芽抱悬液三次。再置于6 5 0C 恒温水浴加 热3 0 m i n，然 后取生理盐水5 0 m L 制成芽抱悬液。置4 冰箱中 可保存一个月。7.2.2 蜡样芽抱杆菌悬液用量
7、的测定 在实际检 定前先试几个平 板，即把 不同浓度的芽抱悬液加人检 定用培养基中，使0.051+g/-L浓 度的标准四环素 溶液可产生1 2 m m 以上的清晰、完整的 抑菌圈作为最适芽抱用量。一般用最为每1 0 0 m L 检定用培养基内加芽袍悬液0.5 一1.O m L,1.O m L菌悬液中含芽抱数约为l o c o7.2.8 检定用平板的制备 将适量芽抱悬液加人溶化后冷却至5 5 一6 0 的检定用培养基中 混匀。每个平皿内加人培养基6 m L,前后摇动平皿，使含有芽抱的检定培养 基均匀彼盖 于平皿表面，置水平位置上盖 上陶质盖，待凝固 后，于 每 个平 板的培养 表 面放 置6 个
8、牛 津 杯，使牛津 杯在半 径 为2.8 c m 的 圆面 上 成6 0 度角 的间 距。所用 平板须当天制备。了.3 检定7.8.1 标准曲线的绘制 四环素稀释液:取原液用0.1 m o l/L 磷酸盐缓冲溶液稀释成0.0 2 5,0.0 5 0,。.1 0 0,0.2 0 0,0.4 0 0,0.8 0 0 R g/m L 的标准溶液(当天用当天稀释)。取检定用平板1 8 个，分成6 组，每组3 个平 板作为平 行试验。第一组于每个平板的6 个牛津 杯中分别加满。.0 2 5 p g/m L 的标准溶液作为对照组。第二 到第 六组于每个平板上的6 个牛津 杯中，间隔加GB 9 6 9 5.
9、1 6 一 8 8满0.2(0 11 9 m L 的标准溶液作为参考。各组余一 F 的牛津杯，根据组别顺序依次加满0.0 5 0,0.1 0 0,0.2 0 0,0.4 0 0,0.8 0 0 W g i-L 的 标准溶液，经培养后，以 各组 抑菌 圈直 径的校正平均值 绘制 标准曲线。抑菌 圈直 径校正值(m m)等于2 一6 组(0.2 0 0 1 1 9/-L)抑菌圈直径的平均值减去各组抑菌圈直径平均值。用此校正值校正0.0 5 0,0.1 0 0,0.2 0 0,0.4 0 0,0.8 0 0 P g/m L 标准溶液的抑菌圈直径平均值。校正 后的值，包 括0.2 0 0 W g i
10、m L 浓度的平 均值在半对数坐标纸上作图，以 抑菌圈直径为横坐标(算术级)，以浓度为纵坐标(对数级)，通过下列公式绘出标准曲线二(3 a+2 b+c 一e)1 5=(3e+2d+c一a)，5LH式i l l:L-标准曲线的最低浓度的抑菌圈直径;a,b,e 相应浓度是0.0 5 0,0.1 0 0,0 A 0 0 1 g/m L,H-标准曲线的最高浓度的抑菌圈直径;a,d,e 相应浓度是。.0 5 0,0.4 0 0,0.8 0 0 1 g/m L o c参考浓度(0.2 0 0 1t g/m L)的4 5 个抑菌圈直径的平均值。7.3.2 试样中四环素族抗生素残留量的检定 每份试样取3 个检
11、定用平 板，在每个检定用板上，间隔的3 个牛津 杯内加满四 环素标准参 考浓度溶液。另外3 个牛津 杯加满被检试样液，将陶质盖重新盖好，置3 0 士1 培养箱中，培养1 7 士1 h。除去牛津 杯翻 转平 板，精确的测量产生的抑菌翔直径(精确到0.1 m m)。分别求出3 个检定用平板上参考浓度和被检试样抑菌圈直径数值校正后，从四环素标准曲线上查出被检试样中四环素的含量。8 检定结果的计算 从标准曲线上查出被检试样液的抗生素残留量，乘以稀释倍数，结果以m g/k g 计算。附加说明:本标准由中华人民共和国商业部食品局提出。本标准由中国肉类食品综合研究中心归口。本标准由中国肉类食G P F 合研究中 心负责起草。本标准主要起草人裴显庆、张纯。