1、I C S1 1 2 2 0B4 1a 亘中华人民共和国国家标准G B T2 6 6 1 8 2 0 112 0 11-0 6-1 6 发布派琴虫病诊断操作规程P r o t o c o lo fd i a g n o s i sf o rP e r k i n s o s i s2 0 1 1 11-0 1 实施宰瞀徽鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促1 9刖昂G B T2 6 6 1 8 2 0 11本标准的附录A 为规范性附录，附录B 和附录C 为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、福建出
2、入境检验检疫局、黄岛出入境检验检疫局、国家海洋环境监测中心、深圳出入境检验检疫局、上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴绍强、林祥梅、刘建、郑腾、李西峰、梁玉波、刘荭、李建、韩雪清、贾广乐、梅琳。G B T2 6 6 1 8 2 0 11引言派琴虫病是影响世界贝类养殖业发展的主要寄生虫病，为国际兽医局(0 I E)规定的必报水生动物疫病之一。本病1 9 4 6 年首次报道，当时，引起美国路易斯安那州的墨西哥海湾的大批牡蛎(C r a s s o s t r e av i r g i n i c a)死亡。迄今为止，已发现派琴虫存在于美洲、欧洲、澳洲、亚洲和非洲五大洲的许多贝类体内，包括牡蛎
3、、鲍鱼、蛤子、扇贝、珍珠牡蛎、鸟蛤和贻贝等体内，并在许多地区造成了严重的危害，死亡率高达9 5。1 9 9 7 年，我国在栉孔扇贝、虾夷扇贝、皱纹盘鲍、菲律宾蛤仔体内检测到派琴虫。美国2 0 0 5 年也从中国广西北海进口牡蛎中检出派琴虫。目前，派琴虫已经成为影响我国贝类养殖业发展的主要病原之一。据对黄海北部三个海域的菲律宾蛤仔的派琴虫感染状况进行调查的结果表明，除3 月份和6 月份的感染率分别为9 5 和9 0 之外，其他月份感染率均为1 0 0。目前，派琴虫感染的诊断通常依靠O I E 推荐的组织切片法、F T M 组织培养法以及P C R 方法。组织学方法可以通过显微镜下直接观察虫体或观
4、察组织损伤来监测感染的分布情况。F T M 培养派琴虫休眠孢子的方法是将派琴虫滋养体进行培养，培养后，虫体体积增大、细胞壁增厚，而且不繁殖，是一种传统有效的定量检测派琴虫的方法。实时荧光P C R 检测贝类派琴虫的方法敏感度较高，而且特异性强，检测可在一天之内完成，定量准确、全封闭反应等优点。派琴虫病诊断操作规程G B T2 6 6 1 8 2 0 1 11 范围本标准规定了派琴虫病诊断时的样品采集，虫体培养及显微镜检查，P C R 以及荧光P C R 检测操作规程。本标准适用于蛤仔、牡蛎等水生动物及其产品中携带海洋派琴虫(P e r k i n s u sm a r i n u s)、奥尔森
5、派琴虫(P e r k i n s u so l s e n i)等派琴虫的诊断，也可用于派琴虫病的监测和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B T1 8 0 8 8 出入境动物检疫采样3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1派琴虫病P e r k i n s o s i s帕金虫病
6、由海洋派琴虫(P m a r i n u s)、奥尔森派琴虫(P o l s e n i)等在宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病。注：除P m a r i n u s、P o l s e n i 之外，病原还包括P q u g”a d i、P c h e s a p e a k i、P a n d r e w s i 和P m e d i t e r r a n e u s。3 2c t 值c y c l et h r e s h o l d荧光P C R 反应中，荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数。4 材料除另有规定外，所用化学试剂
7、均为分析纯。试验用水要求达到G B T6 6 8 2 中一级水的要求。4 1 液体巯基乙酸盐培养基(f l u i dt h i o g l y e o l l a t em e d i a，F T M)：具体配制方法见附录A。4 2 卢戈氏碘液(L u g o l Si o d i n e)：配制方法见附录A。4 32 5 氯霉素：配制方法见附录A。4 41 制霉菌素：配制方法见附录A。4 5 酚一三氯甲烷抽提法所需要的相关试剂或其他D N A 抽提试剂盒，见附录A。4 61 0 P C Rb u f f e r、2 5m m o l LM g C l 2、d N T P(2 5m m o
8、l L 或1 0m m o l L)、5U 肛Lr T a qD N A 聚合酶等，均为商品化试剂盒中成分。4 7 琼脂糖。4 8 电泳缓冲液：配制方法见附录A。4 9 引物及探针：包括P C R 引物及荧光P C R 引物和探针。1G B T2 6 6 1 8 2 0 1 15 设备5 1 低温培养箱：能够进行2 2 2 4 培养。5 2 生物显微镜。5 3 2 0 普通冰箱、-7 0 的超低温冰箱、4 冰箱。5 4 组织研磨器。5 5 高速冷冻离心机。5 6P C R 扩增仪。5 7 荧光P C R 扩增仪。5 8 电泳仪。5 9 凝胶成像仪或紫外透射仪。5 1 0 水浴锅。6 派琴虫的检
9、测方法6 1 采样6 1 1 采样点的选择按照G B T1 8 0 8 8 规定方法进行。应根据实际情况，一个区域的一个种群至少选取3 个采样点，大范围的几块不连续地区或者养殖易感品种的区域，应增加采样点。6 1 2 采样技术要求6 1 2 1 有临床症状的贝类牡蛎感染派琴虫的症状表现为消化腺发自，贝壳不能闭合，套膜收缩，性腺发育受到抑制、偶尔也会出现脓肿，身体严重衰弱，生长迟缓等。采样时，至少挑选1 0 条濒死的或可疑的个体。采样时贝类应当是活的，贝类应当在活体或杀死后分别包装放在冷藏的容器中送到实验室。所采集的贝类样品应避免冰冻。主要采集贝类的鳃、套膜、消化腺、闭合肌等。6 1 2 2 无
10、临床症状的贝类当养殖场的个体有怀卵时，应每年在产卵期采集一次精液或卵液。如怀卵群体由不同年龄的贝类个体组成，应选取两岁龄的贝类采样。样品应包括该地所有的易感品种。每次采样的贝类数量要以感染率等于或大于2 时检出的概率进行抽样。通常情况是至少采集1 5 0 个贝类。对无临床症状的贝类，取其鳃、套膜、消化腺、闭合肌等。6 1 2 3 监测目的的采样监测时间应选在一年中最能观察到l 临床症状并能检测到该虫的季节。采样数量参见6 1 2 2。6 1 2 4 样品保存及运送采取的样品应在取样后2 4h 内，冷藏送入实验室，要附有标签，清楚标明采样地点、来源和养殖历史，实验室内冷藏保存备检。6 2 虫体培
11、养6 2 1 样品的选择选取垂死的新鲜贝类样品。6 2 2 样品前处理将贝壳弃掉，置于灭菌的研钵，剪刀剪至1m m 3m m 大小。6 2 3 样品的培养将样品分别置于含5m LF T M 培养基的灭菌试管中，加2 5 0p L2 5 的氯霉素摇匀，用1m L1 制霉菌素覆盖在液面，盖好盖子，2 2 2 4 低温培养箱中暗室培养4d 7d。2G B T2 6 6 1 8 2 0 1 16 2 4 样品的纯化将培养后的样品40 0 0r m i n 离心1 0m i n，弃上清液，加6m L2m o l LN a O H，涡旋混匀后置于6 0 烘箱内消化过夜。40 0 0r r a i n 离心
12、1 0m i n，弃上清液，加2m Ld d H：O 洗涤，40 0 0r r a i n 离心1 0r a i n，弃上清液，重复上述步骤2 次4 次。6 2 5 染色镜检将纯化的样品置于2m Ld d H。O 中摇匀，加人8 0p L 卢戈氏碘液染色后，取4 0p L 于载玻片上，盖上盖玻片后，在显微镜(1 0 X 1 0)下顺序观察。6 2 6 结果判断显微镜下，经过F T M 培养后，派琴虫发育为休眠孢子，呈圆形，蓝黑色，直径大多在3 0p-m 8 0p-m。形态参见附录B。6 3P C R 检测6 3 1 材料选取活的或刚死的贝类的鳃组织，也可采用乙醇或者低温保存的贝类鳃组织样品。6
13、 3 2 操作步骤6 3 2 1D N A 的提取取2 5m g 样品，剪碎后见附录A 中提取组织D N A 的方法提取基因组D N A，也可采用商品化的组织基因组D N A 提取试剂盒进行。除检测样品外，需要设立如下对照：取已知感染派琴虫的贝类组织作为阳性对照；取未患病的贝类组织作为阴性对照；空白对照。6 3 2 2 引物上游引物：5-C C G C T T T G T T T G G M T C C C-3 下游引物：5 _ A C A T C A G G C C T T C T A A T G A T G-3 P C R 预期扩增派琴虫属的I T S 区域片段长度为6 6 6b p 6
14、7 2b p(具体序列参见附录c)，引物合成后均采用灭菌d d H：O 均稀释为1 0,u m o l L，-2 0 保存备用。6 3 2 3 反应体系在P C R 管内，加入1 0 P C Rb u f f e r2 5p L、5u p LT a qD N A 聚合酶0 5p L、1 0p m o l L 上下游引物各0 5p L、2 5m m o l Ld N T P2p L、模板D N A1 0b t L、补充d d H 2 0 至2 5p L。P C R 操作时，取等体积的d d H。O 代替D N A 模板作为空白对照。6 3 2 4 扩增程序9 5 预变性4m i n；之后9 5
15、变性1m i n，5 3 退火1m i n，6 5 延伸3r a i n，共4 0 个循环；最后6 5 补充延伸5m i n。6 3 2 5 琼脂糖电泳取5 L LP C R 扩增产物，在1 电泳缓冲液内进行1 2 的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用紫外灯或凝胶成像仪观察是否扩增出预期大小的特异性D N A 片段。6 3 3 结果判定6 3 3 1 试验成立的条件阳性对照有预期大小的扩增条带，阴性对照及空白对照没有相应片段的P C R 产物。否则试验无效。6 3 3 2 样品检测结果在阳性对照、阴性对照、空白对照都成立的前提下，若检测样品有预期大小的条带，则P C R 结果阳性，若检测样品无预期
16、大小的条带，则P C R 结果阴性。3G B T2 6 6 1 8 2 0 116 4 实时荧光P C R 检测6 4 1 实验材料与D N A 提取材料与D N A 的提取以及阴、阳性对照及空白对照的设置同P C R 操作部分。6 4 2 操作步骤6 4 2 1 引物与探针设计上游引物：5，_ C A A A C T C T c A A C G A T G G A T G C C-3 下游引物：5 -T G C A A A T C G C A G T G C T T A T C G-3 T a q M a n 荧光探针：5 I-F A M A C T T C G C T G C G T C C T T C A T C G A T T C T C G-E C L I P S E-3 引物和探针合成后均采用灭菌d d H：0 稀释为1 0F m o l L。扩增片段长度为7 8b p(具体序列参见附录c)。6 4 2 2 反应体系取1 0p L 组织基因组D N A 作为模板，加入按照表1 配制的荧光P C R 反应液中表1 荧光P C R 反应液配制试剂体积,L1 0 x P C R