1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准s N/T 1 0 8 6-2 0 0 2胎儿弯杆菌的分离鉴定方法P r o c e d u r e o f i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n f o r c a mp y l o b a c t o r f e t u s2 0 0 2 一 0 3 门 5 发 布2 0 0 2 一 0 9 一 0 1实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 肩s N/T 1 0 8 6-2 0 0 2前言 本标准是按照G B/T 1.1-1 9 9 3 标准化工 作导则 第1 单
2、元:标准的起草与表述规则 第1 部分:标准编写的基本规定 的要求编写的。本标准依据国际动物流行病管理局(O I E)标准手册，在加拿大国家动物疾病研究所实验室操作规程的基础上，根据国内实验室条件，在不影响检验结果的条件下，对上述规程进行了部分修改而制定的。本标准的附录A是标准的附录，附录 B是提示的附录。本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人:秦贞奎、侯艳梅、张碧波、张立怀。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。中华人 民共和国出入境检验检疫行业标准胎儿弯杆菌的分离鉴定方法s N/T 1 0 8 6-2 0
3、 0 2P r o c e d u r e o f i s o l a t i o n a n d i d e n t i f ic a t i o n f o r c a mp y l o b a c t o r f e t u s范 围本标准规定了胎儿弯杆菌的分离鉴定方法。本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液、流产胎儿、胎衣等的胎儿弯杆菌的检验。其他动物可参照使用。2引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 食品卫生
4、微生物学检验染色法、培养基和试剂 G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法设备和材料混合气体(质量比为 3.5%氧气、1 0%二氧化碳,8 6.5%氮气)。厌氧培养罐。采样棒及吸球。2 mL注射器、5 号针头、2 0 号针头。1 0 m L灭菌瓶及生理盐水。供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料.培养基和试剂 月.八了1月qJCU .IJIJ伪J口J几工J，J伪JJ叼增菌运输培养基(T E M)配制方法见附录A之 A1,半脆氨酸牛心浸膏培养基(C H):配制方法见附录 A之 A 2,M u e ll e r H i n t o n A g a r(M H):配制方
5、法见附录A之A 3 o琉基乙酸盐肉汤(T h io g l y C o l l a t e B r o t h):配制方法见附录A之A4,各种相应生化培养基(配制方法见 G B 4 7 8 9.2 8),.，Ln可:5 样品采集与处理51 母牛站立或六柱栏保定，用 5%来苏儿消毒牛的外阴部，将无菌采样棒一端的吸球压扁，将采样端插人阴道中并来回抽动.吸取阴道粘液。取出采样棒后，插人盛有 3 m l灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次，即为冲洗液。冲洗液静置 1 mi n-2 mi n，用灭菌注射器吸取上清液2 ml 分别注人两瓶增菌运输培养基中，每瓶 1 m l,振荡混匀。尽快送至实验室。接种样品的丁
6、E M 培养基运输途中应保存在 1 8 C且不超过 4 8 h.5.2 公牛六柱栏保定，用绳子固定采样侧的后肢，剪短阴筒外部的阴毛，用 5%的来苏儿消毒公牛的尿道口，将无菌采样棒的采样端插人阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包皮粘液。取出采样棒中华人民共和国国家质，监督检验检疫总局2 0 0 2-0 3-1 5 批准2 0 0 2-0 9-0 1 实施 工S N/T 1 0 8 6-2 0 0 2迅速插人盛有 3 mL灭菌生理盐水的无菌瓶中吹吸数次，即为冲洗液。冲洗液静置 1 min-2 mi n，用灭菌注射器吸 取上清液2 m L，分别注人两瓶增菌 运翰培养基中，每瓶1 m l,。振
7、荡混匀。尽快送至实验室。接种样品的T E M 培养基运输途中应保存在 1 8 且不超过 4 8 h o5.3 冷冻精液:精液尽可能在无菌条件下采取，将精液装人无菌瓶中，密封后送往实验室。5.4 流产胎儿、胎衣;流产胎儿胃内容物用棉拭子直接接种到含抗菌素的MH或CH琼脂平板上;胎衣、流产胎儿的肺、肝，表面火焰消毒后用生理盐水匀浆，制成匀浆液。6 分离培养6.，取样品做革兰氏染色并做湿涂片镜检。6.2 可用棉拭子蘸取冲 洗液 或匀浆液直接涂布于含抗菌素的M H或C H琼脂平板上。6.3 已接种样品的增菌运输培养基置 3 7 C培养7 2 h。用直径 3 mm的接种环将增菌液分别划线于两个 MH或C
8、 H平板培养基上。6.4 将所有 MH或C H平板放置厌氧培养罐中，密闭后将罐内空气抽出，达到一5.5 k P a时停止，充人经。.2 2 JA M滤膜过滤的混合气体至气压为零 再将气体抽出和充人反复两次。将培养罐置 3 7 C 培养7 2 h,6.5 观察 MH,C H培养基上有无疑为胎儿弯杆菌的菌落，如无可弃之。将典型或可疑菌落划线于 MH或 C H琼脂平板培养基上培养7 2 h,胎儿弯杆菌在MH或C H平板培养基上的菌落特征为:不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直径为 1 mm左右。了 鉴定7.，筛选试验7.1.1 取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化
9、氢酶试验(见GB 4 7 8 9.2 8),胎儿弯杆菌为革兰氏染色阴性，呈螺旋状或 S”状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形成芽胞和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征性快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验均为阳性。表 1 胎 儿弯杆 菌生 化反应菌 名过 氧 化氢酶试验硫 化 氢 试 验生长试验药敏试验马 尿 酸 钠水 解 试 验氧 化 酶试 验2 5,C4 2 C1%甘 氮 酸1%胆 汁3 5%抓 化 钠蔡 吮 酮 酸3 0 fa g/片头抱露素3 0 f.g/片胎儿弯杆菌胎 儿亚 种+十十十十RS+胎儿弯杆菌性 病亚 种+十+RS+注:“+”一阳性反应;“一”一阴性反应;0 R，一拮抗
10、 S 一敏夔多7.1.2 纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中，以备进一步做生化试验用。7.2 生化试验 将符合7.1.1 的纯培养物按表1 进行生化试验。所有生化试验管均于混合气 体环境中培养3 d。带胶盖或螺旋盖的试管，培养时应将试管盖放松。7.2.1 硫化氢 试验:纯培养后的可疑菌株接种于T h io g l y c o l la t e 肉汤中。试管口悬一2 0 m m X&m m的乙酸铅滤纸条 观察 3d-4 d，如见滤纸变黑即为硫化氢试验阳性。7.2.2 生长试验:纯培养后的细菌接种到2 管T h io g l y c o ll a t。肉汤中，分别在4 3 C,2 5 C温箱中培
11、养7 2 h观察结果，肉汤上层出现雾状混浊时，说明细菌已生长。zs N/r 1 0 8 6-2 0 0 27.2.3 甘氨酸、抓化钠、胆汁生长试验:可疑菌种分别接种于含 1%甘氨酸,3.5%抓化钠、1%胆汁生长的T h io g l y c o l l a t e 肉汤中，3 7 C 培养7 2 h,培养基近表面有 云雾状生长为阳 性.7.2.4 药物敏感试验:挑取可疑 菌落放于1 M I，灭菌生理盐水试管中，菌液浓度为3 X 1 0.个/m l，用灭菌的棉拭子葩取细菌稀释液涂于 MH血琼脂平板上，然后用镊子把含有3 0 p g蔡咤酮酸和头抱霉素的滤纸片贴在MH血琼脂平板上，在混合气体中 3
12、7 C培养 2 4 h-7 2 h,测量溶菌区，直径)1 8 mm为敏感，直径簇1 4 m m为不敏感。7.2.5 马尿酸钠水解试验:取 4 8 h-7 2 h培养物接种于。.4 ml,1%马尿酸钠溶液中制成浓菌悬液，3 5 C-3 7 C 水浴 2 h，再加人 0.2 mL苟三酮试剂，混匀后水浴 2 0 min，然后观察结果，变深紫色为阳性，淡紫色或不变色为阴性。可用 1 8 h-2 4 h 变形杆菌培养物作阳性对照。7.3 根据7.1 和 7.2 的结果进行判定。7.3.1 凡符合胎儿弯杆菌一般特征的细菌，按表 1的生化反应特征进一步判定是否为“胎儿弯杆菌胎儿亚种”或“胎儿弯杆菌性病亚种”
13、，在判定亚种时，在表 1的生化反应中，有一项不符合均判定为非胎儿弯杆 菌。8报告结果8.1 阳性结果:“发现胎儿弯杆菌胎儿亚种”或“发现胎儿弯杆菌性病亚种”。8.2 阴性结果:“未发现胎儿弯杆菌”。S N/T 1 0 8 6-2 0 0 2 附录A(标准的附录)培养荃和试剂A 1 增菌运输培养荃(t r a n s p o r t E n r i c h m e n t m e d i u m)成牛血清1 0 0 0 mL 5-氟尿咯陡。3 g 放线菌酮。.1 9 蔡陡酮酸3 mg 多粘菌素B 1 0 0 0 0 0 单位 1%煌绿5 ml.将各种成分无菌操作加入到成牛血清中，充分混合后分装于
14、 2 0 m L带胶皮塞(能密闭)的玻璃瓶中，每瓶 8 ml，然后水浴或在蒸气中加热 2 mi n-3 m i n(无压力)，使血清凝固。冷却后用灭菌玻璃棒捣碎血清凝块。最后无菌操作充人混合气体(3.5%氧气、1 0%二氧化碳,8 6.5 0 0 氮气)。将制备好的T E M培养基保存在4 C冰箱中，可使用4个月。A 2 C H培养基(c y s t e i n e h e a r t b l o o d a g a r)(含 抗菌紊)，牛心浸液(或牛心粉3 0 g)5 0 0 g Tr y p t o s e 1 0 g 右 旋糖1 0 g 抓化钠59 L 一 半胧氨酸1g 琼脂1 2 9
15、蒸馏水2 1 0 0 0 mL p H 7.0 7.2 加热溶解各成分后 1 0 7.9 k P a 高压 1 5 mi n，培养基冷却至5 0 C-5 5 C时，无菌加人:多枯菌素B 2 m g 新生霉素2 mg 放线菌酮2 0 m g 绵羊血1 0 0 mL 混匀，倾注平板。放4C 水箱备用。A 3 MH培养基(mu e l l e r h i n t o n a g a r)(含抗菌素)牛肉浸膏5 g 酪蛋白 水解物1 7.5 g 淀粉1.5 g 琼脂1 5 g 蒸馏水，1 0 0 0 mL”新制备的培养基均应做无菌检查，并用已知阳性菌和阴性菌进行测试，以保证培养基的质量。2)本标准所用
16、水为GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2中规定的三级水。S N/T 1 0 8 6-2 0 0 2 p H7.2 士0.2各成分加热溶解,1 0 7.9 k P a高压 1 5 m i n，冷却至5 0 C-5 5 C时，无菌加入:杆菌肤2 5 0 0 0 单位 放线菌酮5 0 m g 多粘菌素B 1 0 0 0 0 单位 新生霉素5 m g 绵羊血5 0 ML-1 0 0 MI混匀.倾 注平板。4C冰箱保存。A 4 筑基乙酸盐肉汤(t h i o g l y c o l l a t e b r o t h)L-肤 氨酸。.5 m g 抓化钠2.5 m g 右旋糖5.5 9 醉母浸膏5.0 g 酪蛋白胰消化物 (p a n c r e a t i c d i g e s t o f c a s e i n)1 5.0 g 琉基乙酸钠。.59 蒸馏水2 1 0 0 0 MI加热至溶解，调整 p H至7.2 士0.2,5 m L试管分装，1 0 7.9 k P a高压灭菌 1 5 m i n,马尿酸钠水解试验试荆A5.21%马尿酸钠:马尿酸钠 蒸馏水2)水合苟三酮:茹三酮 丙酮 丁酮亡