1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 5 2-2 0 0 2鲤春病毒血症病毒(S V C V)逆转录-聚合酶链式反应(R T-P C R)检测方法 T e s t m e t h o d o f r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n(R T-P C R)f o r s p r i n g v i r a e m i a o f c a r p v i r u s(S V C V)2 0 0 2-1 1-2 5发布2 0 0 3-0 5-0 1
2、 实施中华人民共和匡国家 质 量 监 督 检验 检 疫 总 辰S N/T 1 1 5 2-2 0 0 2nil吕本标准是在总结我国在这一领域的实践经验并参考国际上有关检测规程的基础上制定的。本标准的附录 A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:江育林、高隆英、刘羞、史秀杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 5 2-2 0 0 2鲤春病毒血症病毒【S V C V)逆转录-聚合酶链式反应(R T-P C R)检测方法范围本标准规定了细胞分离病毒后，用P C R技术诊断S v c病毒的方
3、法。本标准适用于S v c病毒的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日 期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法(e q v I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)GB/T 1 8 0 8 8-2 0 0 0 出人境动物检疫采样试荆和材料3.1 水 应符合 G B/T
4、 6 6 8 2-1 9 9 2中一级水的规格。用于P C R(包括核酸抽提)时所用的水要用 D E P C处理以除掉 R N A酶。3.2 S V C病毒标准株3.3 T a q酶 一2 0 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4 逆转录酶 A MV 1 0 U/m L。一2 0 保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5 R N A抑制剂(R N a s i n)4 0 U/p L。-2 0 保存，不要反复冻 融或温度剧烈 变化。3.6 d N T P(含 d C T P,d G T P,d AT P,d T T P各 1 0 mmo L/L)3.7引物 该试验选用S v c 病毒的糖蛋白
5、 基因作为P C R的 模板。该基因长1 5 8 8 b y，在这里用了2 对引物:F 1 和R 2 扩增该基因中的7 1 4 b y 片断，而F l 和R 4 则从该片断中再扩增6 0 6 b y 片断。所以实际上是“半嵌套式”的P C R(s e m i-n e s t e d P C R)。使用时浓度为4 0 p m o l/L。其序列如下:R2:5-AGA TGG TAT GGA C CC C AA TAC ATH C AN CAY-3 R4:5-CT G GGG TTT CCN CC T C AA AGY TGY-3 Fl:5 -TCT TGG AGC C AA ATA GCT CA
6、R RTC-3 S N/T 1 1 5 2-2 0 0 23.8 无水乙醇 分析纯，使用前预冷到一2 0 C.3.9 矿物油 要求无D NA酶和R N A酶.4 器材和设备4.1 9 6 孔细胞培养板4.2 倒置显微镜4.3 恒温培养箱4.4 普通冰箱和低温冰箱4.5 组织研磨器46 离心机和离心管4.7 P C R扩增仪4.8 电泳仪4.9 微量移液器及吸头4.1 0 紫外观察灯5 S V C病毒的分离5.1 采样 对有临床症状的鱼，如是体长小于等于 4 c m的鱼苗取整条鱼，体长 4 c m-6 c m的鱼苗取内脏(包括肾);体长大干6 c m的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、
7、脾、鳃和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。按G B/T 1 8 0 8 8-2 0 0 0 采样。5.2 样品处理 应在 1 0 以下。先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再按 1:1 0的最终稀释度重悬于培养液中.如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有 1 0 0 0 TU/mL青霉素和1 0 0 0 p g/m L 链霉素的 培养液中，于1 5 C 下孵育2 h-4 h 或4 下孵育6 h-2 4 h,7 0 0 0 r/m i n 离心1 5 mi n，收集上清液。卵巢液也要用上述浓度的抗菌素处理以防污染。不必匀浆但需稀释 2 倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的
8、步骤中直接用其上清液。5.3 病毒分离 对 1:1 0 的 组织匀浆上清液再作两次1 0 倍稀释，然后将这1:1 0,1:1 0 0 和 1:1 0 0 0 3 个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约 2 4 h的E P C,C O或者 F HM细胞单层中，每孔(2 c m )的细胞单层 最多 接种1 0 0 t L 稀释液。1 5 C-2 0 吸附。5 h-l h 后，加人细胞培养液。置于1 8 士2 培养。试验中要有 2 孔阳性对照(接种S V C标准株)，和空白对照(未接种病毒的细胞)。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用 4 0 倍到 1 0 0倍倒置显微镜检查。空白对照细
9、胞应当 正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的 细胞培养中出现细胞病变(C P E)，应立即 进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有C P E出现，则在培养 7d 后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以 7。r/mi n,4 C 离心 1 5 mi n，收集上清液将上清液接种到新鲜细胞单层，培养 7 d。每天用 4 0倍到 1 0 0倍倒置显微镜检查。如果阳性对照也未出现 C P E，则必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。S N/T 1 1 5 2-2 0 0 26 S V C病毒的鉴定6.1 样品处理 将4 5
10、0 川 细胞病变悬液放人1.5 M I的离心管，再加人4 5 0 川 一 C T A B 溶液(见附录A.1)并混匀，2 5 作用2 h,6.Z R N A抽提 在含有样品的塑料离心管中加人 6 0 0 I e L抽提液 2(见附录 A.3)，用力混合至少 3 0 s,1 2 0 0 0 r/m i n 离心5 m i n，小心取上层水相(约8 0 0 I t L)，再加人7 0 0 Ia L 抽提液1(见附录A.2)，用力混合至少3 0 s,1 2 0 0 0 r/m i n 离心5 m i n，小心取上层水相 约6 0 0 沙)。再加人一2 0 预冷的1.5 倍体积的 无水乙 醉(约9 0
11、 0 p L)，倒置 数次混匀后，-2 0 C 8 h 以 上沉淀核酸。1 2 0 0 0 r/m i n 离心3 0 m i n，小心弃去上清。干澡后加1 0 p L 水溶解，用作P C R 模板。6.3 变性和退火 在P C R 管中 加人1 0 M L 模板和2.5 p L 引物R 2，加2.5 p L 水使总体积为1 5 p L,置于7 0 反应5 m i n。立即冰浴，低速离心约5s，使液体集中在底部。6.4 c D N A合成 在上述 反应 管中 继续加人:5 P L的5 倍逆转录酶浓缩缓冲液(见附录A.5),2 p L d N T P,O.5;A LR N A酶抑制剂(2 0 U
12、),1 p I 逆转录酶A M V(1 0 U)和1.5 P I 水口6.5 P C R扩增 D N A 在上述反应管中 再继 续加人:1 0 倍T a q 酶用浓缩缓冲液(见附录A.7)8 p L,2 5 m m o l/L的氯化镁(见 附录A.6)8 p l.,d N T P 2 p I、引物R 2 2 p 1 和引物F l 2 p L,T a q 酶5 U、加水到总体积为1 0 0 p L,每管加入5 0 醉，矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于 P C R扩增仪。先9 4 C 4 m i n-5 0 C 1 mi n-7 2 C 1 m i n，再9 4 C 1 m
13、 i n-5 0 1 mi n-7 2 0C 1 m i n,3 0 次循环，然后7 2 C8 m i n,最后 4*C 保温。6 6 琼脂糖电泳 用T B E 电泳缓冲液(见附录A.4)配制2 写 的琼脂糖(含。.5 p g/m L E B 见附录A.8)平板。将平板放人水平电 泳槽，使电泳缓冲 液刚好淹没胶面 将6 p L 样品和2 P L样品缓冲液(见附录A.9)混匀后加人样品孔。在电泳时设立D N A标准分子量作对照，推荐使用p U C 1 9 D N A/Ms p(H p a l l),5 V/c m电泳约。，5卜，当浪酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察核酸带并判断结果。6.7 嵌
14、套式 P CR 如果P C R后产物电泳时看不到D N A带，取 5 p L产物做模板;如果P C R后产物电泳时能看到D N A带，只 是要求进一步核实，则需将产物按1,1 0 0 0 稀释后 取5 醉 做模板。然后依次加人以下试剂 T a q 酶5 U,d N T P 2 p L，引物R 4 2.5 p L 和引物F l 2.5 p L,1 0 倍用浓缩的T a q 酶缓冲液1 0 p L,2 5 m m o l/L 的M g C l,1 0 p L、加水到总体积为1 0 0 p L a 每管加人5 0 M L 矿物油 短时间低速离心让矿物油 集中在上层。再将反应管置于P C R扩增仪.先
15、9 4 C 4 m i n-5 0 C 1 m i n-7 2 C 1 m i n，再9 4 C 1 m in-5 0 C 1 m i n-7 2 C 1 m i n,3 0 次循环，然后7 2 C 8 min，最后4 C保温。6.8 设立对照6.8.1 在6.1 样品处理过程中 必须设立阳 性对照、阴性对照和空白 对照，6.8.2 取含有已 知S V C病毒标准株的细胞悬液作为阳 性对照。68.3 取正常的细胞悬液作为阴性对照。6.8.4 W%休VN水代替模板作为空白对照.S N/T 1 1 5 2-2 0 0 27 结果判定 样品经过接种细胞和盲传后均没有 C P E出现，则结果判为阴性。
16、有 C P E出现，则要用 F U R万沃进行鉴定是否由S V C病毒引起。P C R后阳 性对照会出现 一条7 1 4 b y 的D N A片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。嵌套式P C R 后阳性 对照会出 现一条6 0 6 b y 的D N A片 段。阴 性对照和 空白 对照均没有 该核酸带。待测样品P C R扩增后能在相应 7 1 4 b y D N A位置上有带，或者嵌套式 P C R扩增后能在相应6 0 6 b y 位置上有带，均可判为阳 性。无带或带的大小 不是7 1 4 b y 或6 0 6 b y 的均判为阴性。S N/T 1 1 5 2-2 0 0 2 附录A (资料性附录)试剂配制A.1 C T A B溶液 按C T A B 2%,氯化钠1.4 m o l/L,E D T A 2 0 m m o l/L,T r i s-H C I 2 0 m m o l/L p H=7.5 配制。用前加琉基乙 醇至 终浓度为。.2 5 0 0,A.2 抽提液 1 将三氯甲烷/异戊醇按 2 4:1 的比例混合，密闭避光保存。A.3 抽提液 2 1 m o l/l.T r i s