1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 6 4.2-2 0 0 3牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验 操作规程P r o t o c o l o f mi c r o-s e r u m n e u t r a l i z a t i o n t e s t f o r i n f e c t i o u s b o v i n e r h i n o t r a c h e i t i s2 0 0 3-0 3-1 7 发布2 0 0 3-0 9-0 1 实施中华国 家 质 人民共和国量 监 督 检 验 检 疫 总 局S N/T 1 1 6 4.2-2 0 0 3H 1i舀
2、 本标准的试验方法是参考国际兽疫局(O I E)诊断试验和疫苗标准手册 介绍的方法，并经过长期实践、改进，使之进一步具体化，而形成现行的标准。本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人:苏卫、张晓丁、王涛、李凌枫。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 6 4.2-2 0 0 3牛传染性鼻气管炎微It血清中和试验 操作规程范围本标准规定了牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验方法。本标准适用于牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本
3、标准的条款。凡是注 日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本标准。CP E致细胞病变作用。3.2T CI Ds o半数组织培养感染量.3.3I B R牛传染性鼻气管炎。原理 动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，从而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵人，使病毒失去感染力。微量血清中和试验是在微量细胞培养
4、板上，用已知标准病毒株测定未知血清抗体。当相应的抗原抗体发生中和反应后，阻止了已知病毒对敏感细胞的侵袭，从而细胞不出现病变。5 试剂和材料5.1 本标准所用水应符合 G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2中一级水的规定。5.2 本标准所用溶液配制见附录 A,5.3 I B R标准毒株(B a i t h a-Nu/6 7 冻干毒或其他标准毒株)和标准阳性、阴性血清(由指定单位提供)。5.4 细胞:使用 MD B K细胞或三代以内体外培养的未感染 I B R病毒的胎牛肾细胞(B K),皋丸细胞(B T)，细胞浓度约为3 X 1 0 s/ml.,B K或B T细胞的制备:无菌采取初生犊牛肾或架
5、丸，磨碎或剪碎，再 IS N/T 1 1 6 4.2-2 0 0 3用胰蛋白酶消化制备细胞，置3 7 二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。5.5 被检血清:用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清编号后备用。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清须经5 6 C 3 0 mi n 处理。6 器械和设备6，飞 倒置光学显微镜。6.2 二氧化碳培养箱。6.3 冰箱(一2 0 C 保存血清，一7 0 保存种毒)。6.4 无菌9 6 孔细胞培养板，5 0 p L,1 0 0 p L 微量可调移液器，无菌塑料滴头，无菌塑料离心管(1.5 m L)或5 M L-1 0 ml无菌玻璃试管。
6、种毒繁殖 将冻干I B R标准毒用不含血清的维持液(配制见附录A)作 1 0倍稀释，取长成良好单层的细胞，用#a r l e 液(配制见附录 A)洗一次后，按原培养液十分之一的量接毒，置3 7 C温箱吸附0.5 h-1 h，然后加人维持液(配制见附录A)至原培养液量，置 3 7 二氧化碳培养箱培养，逐日观察，待8 0%-9 0%细胞出现病变时收获病毒悬液冻融或超声波处理后，3 0 0 0 r/min离心 1 0 mi n，取上清液，测定病毒毒力滴度(T C I D a o)并分装小瓶，置一7 0 C 贮存备用。病 毒毒力测定 制备的病毒抗原或购进的标准病毒抗原，用维持液将其作 1 0 倍递增稀
7、释至 1 0-e，每一个滴度病毒稀释液接种细胞培养板八孔，每孔5 0 p L,随后每孔加人细胞悬液(3 X1 0 5/m L)1 0 0 p L和 细胞培养液5 0 F L。同时每板设八孔细胞对照。置3 7 二氧化碳培养箱培养，逐日 观察至6 d 并记录细 胞病变，按R e e d-Mu e n c h 方 法计 算培养细 胞半 数感染量(T C I D;a/5 0 p L).9 试 验程序9.1 阴性 血清对照:设二孔，每孔加阴 性血清5 0 p L,1 0 0 T C I D;o/5 0 p L 的病毒悬液5 0 pL，置3 7 C 温箱中和 1h9.2 阳 性血清对照:先将阳性血清作1，
8、2,1，4 稀释至2-7，每一稀释度二孔，每孔加阳 性血清5 0 p L,1 0 0 T C I D;o/5 0 p I的 病毒悬液5 0 t i，置3 7 C 温箱中和1 h.9.3 细胞 对照:设四孔细胞对照(每孔加维持液1 0 0 川 一)。9.4 病毒回归 对照:将I B R病毒稀释成1 0 0,1 0,1,0.1 T C I D;o/5 0 p L，每一稀释度孔，每孔加病毒悬液5 0 t i、维持液5 0 t I9.5 被检血清:将每份被检血清按二倍系列从原血清作倍比稀释，每一稀释度作二孔，每份血清用原血清作毒性对照 每孔加不同稀释度血清5 0 p L,1 0 0 T C I D;o
9、/5 0 F a L的病毒悬液5 0 Il L,TL 3 7 C 温箱中和 1 h,9.6 将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成3 X 1 0 5/ml的细胞悬液，加人上述对照和被检血清组各孔1 0 0 p L,混匀 置3 7 C 5%二氧化碳 培养箱培养。1 0 结果判定1 0.1 接种后 7 2 h 判定结果。当阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常，病毒回归对照在出现下列情况时，方能判定，否则被认为无效。1 0 0 T C I D 5,/5 0 川:均出 现细胞病变;1 0 T C I D;o/5 0 f I:均出现细胞病变;S
10、N/T 1 1 6 4.2-2 0 0 3 1 T C I 几 0/5 0 p L:半数细胞出现病变;0.1 T C I D;o/5 0 M L:细胞未出现病变。1 0.2 判定标准:被检血清的效价为能抑制5 0%或5 0 以 上的细 胞孔出现 病变的 血清最高稀释度;未稀释的被检血清能抑制5 0%或 5 0%以上的细胞孔出现病变者判为阳性。S N/T 1 1 6 4.2-2 0 0 3 附录A (规范性附录)溶液配制A.1 培养液 1 9 9 培养基(或ME M培养基)，加人含1 0 环无 病毒 抗体胎牛血清，抽 滤除菌，加青霉素2 0 0 p g/m L,链霉素 2 0 0 p g/m L
11、,A2 维持液 1 9 9 培养基(或ME M培养基)，加人含2%无病毒抗体胎牛血清，抽滤除菌，加青霉素2 0 0 p g/m L,链霉素2 0 0 p g/m L,A.3 细胞分散液 胰蛋白酶 乙二胺四乙酸二钠(E D T A)无钙镁 P BS 混匀抽滤除菌。A.4无钙镁 P B S2.5 0 g0.2 0 g1 0 0 0 mL 氯化钠(N a C D 8.0 g 氯化钾(K C L)0.2 g 磷酸氢二钠(N a,H P O,)1.1 5 g 磷酸二氢钾(K H z P O,)0.2 g 一级水1 0 0 0 mL将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌(6 8.9 4 k P a 1 5 m
12、i n)或抽滤除菌备用。A.5 Ea r l e液A.5.1 原液 甲 氯化钠(N a C U 氯化钾(K C l)磷酸二氢钠 水(N a H,P O,HB O)葡萄糖 将以上各成分溶解于水中 加水至5 0 0 mLA.5.2原液乙 氯化钠(N a C D 氯化镁(Mg c l,6 H,O)。4%酚红液 将以上各成分溶解于水中，加水至5 0 0 mLA.5.3 E a r l e液配制 按下述比例配成 E a r l e氏液 6 8.0 g 4.0 g 1.4 g 1 0.09。加三叙甲烷 1 mL防腐，置0 C-4 C冰箱内备用。2.0 g 1.7 g S O m L。加三抓甲烷 1 r n L防腐，置 O C-4 冰箱内备用。S N/T 1 1 6 4.2-2 0 0 3 原液 甲1份 原液 乙1份 一级水1 8 份 6 8.9 4 k P a 1 5 mi n灭菌后，置 0 C-4 冰箱内备用。使用时加 7.5%碳酸氢钠(N a H C q)液调p H 7.2 -7.6,