1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 7 2-2 0 0 3鸡白血病检测方法琼脂免疫扩散试验D e t e c t i o n a v i a n l e u c o s i s/s a r c o m a a n t i g e n s-P r o t o c o l o f a g a r g e l i m mu n o d i f f u s i o n t e s t2 0 0 3-0 3-1 7 发布2 0 0 3-0 9-0 1实施中华人民共和匡国家 质 量 监 督检 验 检 疫 总 媛S N/T 1 1 7 2-2 0 0 3前言本标准主要参考 中华人民共
2、和国进出境动物检疫规程手册(1 9 9 7)第2.6.1 2 的内容而制定。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:叶奕优、黄运生、杨宝华。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 7 2-2 0 0 3引言 禽白血病肉瘤复合症是由禽白血病肉瘤病毒群引起的禽类(主要是鸡)多种具有传染性的良性和恶性肿瘤，在自然条件下最常见的是淋巴细胞性白血病，其次为成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病、骨髓细胞瘤、内皮瘤、纤维肉瘤和骨化石等。大多数肿瘤与造血系统有关，少数侵害其他组织。本病在自然条件下只有鸡能感染。传染源为病
3、鸡和带毒鸡，尤其是带毒鸡在本病传播中起着重要作用。有毒血症的母鸡，本身没有症状而生下的蛋常带有病毒，孵出病雏带毒，它再与健康雏鸡接触时可以扩大传染到整个鸡群。先天感染的雏鸡常有免疫耐受现象，它不产生抗肿瘤病毒抗体，长成母鸡后，长期带毒排毒，成为重要的传染源。后天接触感染的雏鸡的带毒排毒现象与接触感染时雏鸡的日龄有很大关系，雏鸡在2 周龄以内感染这种病毒，发病率和死亡率很高，残存母鸡生下的蛋带有病毒的比例也很高。4至8 周龄鸡感染后，发病死亡数大大降低，1 0周龄以上的鸡则可以不发病，其蛋不带毒。此病世界各国均有存在，一些养鸡业发达国家，大多数鸡群都感染此病。我国农业部于 1 9 9 2 年公布
4、的 进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录 把该病列人二类传染病名录中。该病的诊断方法主要是病原学检查，方法有补体结合(C F)试验、抵抗力诱发因子(R I F)试验、表型混合(P M)试验、琼脂扩散试验、E L I S A与荧光抗体试验，其中以P M比较准确可靠，是目前世界上检查淋巴细胞性白血病病毒比较常用的方法，主要用于 S P F鸡群的建立和监测,R I F试验可用于鉴定病毒亚群，琼脂扩散试验用于检测鸡体内禽白血病病毒群特异性抗原，操作简便，可作群体疫情监测。S N/T 1 1 7 2-2 0 0 3鸡白血病检测方法琼脂免疫扩散试验范围 本标准规定了用已知鸽抗劳氏肉瘤病毒抗体，应用琼脂免疫
5、扩散试验，检测鸡体内白血病病毒群特异性抗原。本标准适用于5日龄以上鸡的白血病的检疫、疫情监测以及流行病学的调查。2 试 验原理 琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷却后凝固形成凝胶，琼脂糖凝胶呈多孔结构，其孔径大小取决于琼脂糖的浓度。1%琼脂糖凝胶的孔径约 8 5 n m，这一孔径范围能允许各种抗原抗体分子在琼脂糖凝胶中自由扩散，并由近及远形成浓度梯度，当二者相遇时，在比例适当处发生结合而形成沉淀，反应的沉淀物因其颗粒较大，故在凝胶中不再抗散，而形成沉淀带。根据有无沉淀带的形成判断是否存在相应的抗原抗体免疫反应，从而判断样品中是否存在相应的抗原。3 器材与试验准备3.1 试剂3.
6、1.1 标准阳性血清:鸽抗劳氏肉瘤病毒血清，由指定单位提供3.1.2 标准抗原:禽白 血病抗原，由指定 单位提供。3.1.3 琼脂搪。3,1.4 硼酸缓冲液 p H 8.6 四硼酸钠889 硼酸4.6 5 g 蒸馏水加至1 0 0 0 mL3.1.5 1 0 0 硫柳汞溶液。3.1.6 生理盐水。3.2器材3.2.1 天平。3.2.2 外径 5 mm、孔距 3 mm的7 孔梅花样金属打孔器，外径 5 m m打孔器.3.2.3 玻璃棒(直径 0.4 c m、长1 5 c m),3.2.4 直径 9 0 mm平皿。3.2.5 直径 1 5 mm长 1 1 0 mm试管3.2.6 微量移液器(2 0
7、 p L-2 0 0 p L),3.3 琼脂平板的制备3.3.1 称取琼脂糖，用含。.0 1%硫 柳汞的p H 8.6 的硼酸缓冲 液制成1%琼脂糖溶液，隔水煮沸溶化1，。3.3.2 将直径9 0 m m的平皿置水平台上，倒人3.3.1 中配好的琼脂糖溶液约 1 8 m 工，注意不要产生气泡，冷凝后将平皿倒置放4 保存，2周内使用。ll可用水浴锅或微波炉把琼脂糖隔水煮沸溶化。S N/T 1 1 7 2-2 0 0 33.3.3 打孔:按图1 或图 2 的图形打孔，孔径 5.0 mm，孔距3.0 mm。孔内琼脂用针头小心挑出，勿破坏周围琼脂，打孔结束后，将平板底部经过酒精灯火焰上方来回5 次7
8、次封底，以防渗漏。图 1 样品少时使用 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 O 0 0 0 0。图 2 样品多时使用3.4 被检样品的处理 用鸡的羽髓做被检材料，视鸡只的大小拔取 2根一6 根带髓翅羽，剪下带髓的羽轴基部，置于试管内，加生理盐水。.1 m L-0.2 m L，用玻璃棒将羽髓压出，再置低温冰箱冻融三次，即为被检样品。4操作方法 将打好孔的琼脂板标上日期、编号，用微量移液器加样，每加一个样品换一个吸头，按上图标明B的孔加标准阳性血清，标明(+)的孑 L 加标准抗原，其余孔按编号加被检样品，每孔以加满不溢为度，勿有气泡。待孔中液体渗人琼脂后，将平皿倒置，放人
9、带盖湿盒中、于室温(2 0 0 C以上)或 3 7 温箱中反应，分别在 2 4 h,4 8 h 观察并记录结果5结果判定5.1 判定方法 将琼脂板置暗背景光照下观察，标准抗原孔与标准阳性血清孔间应有清晰沉淀线，否则试验不成立，应重做。5.2 判定标准5.2.1 阳性 被检样品与标准阳性血清孔间形成沉淀线，此沉淀线又与标准阳性血清、标准抗原孔间沉淀线相融洽;或被检样品与标准阳性血清孔间虽未形成沉淀线，但相邻的标准抗原孔与标准阳性血清孔间的沉淀线末端在被检样品孔侧向标准阳性血清孔偏弯，且超过标准阳性血清孔与被检样品孔间的中心连线。5.2.2阴性 被检样品孔与标准阳性血清孔间不形成沉淀线且相邻的标准抗原孔与标准阳性血清孔间的沉淀线直伸向该被检样品孔。5.2.3 疑似 被检样品孔与标准阳性血清孔间不形成沉淀线，相邻的标准抗原孔与标准阳性血清孔间形成的沉淀线向标准阳性血清孔侧偏弯不超过标准阳性血清孔与被检样品孔间的中心连线，则为疑似反应，对该份样品应复检，仍为疑似则判为阳性。