1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 8 1.2-2 0 0 3口蹄疫病毒抗体检测方法 微量血清中和试验D e t e c t i o n a n t i b o d i e s a g a i n s t f o o t a n d mo u t h d i s e a s e v i r u s-Pr o t o c o l o f mi c r o-s e r u m ne u t r a l i z a t i o n t e s t2 0 0 3-0 3-1 7 发布2 0 0 3-0 9-0 1实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 肩S
2、 N/T 1 1 8 1.2-2 0 0 3曰 出.吝 月g青本标准根据采用 O I E 诊断试验与疫苗标准手册 2 0 0 0 年第四版 2.1.1 章的相关内容起草。本标准的附录A、附录 B是标准的资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:杨素、薛景山、吕宏、冯家望。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 8 1.2-2 0 0 3口蹄疫病毒抗体检测方法微量血清中和试验范围本标准规定了口蹄疫病毒微量血清中和试验方法。本标准适用于口蹄疫病毒中和抗体水平的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的
3、条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是往日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或 修订 版均不 适用于 本标准，然而，鼓励根据 本标准 达成协 议的各方 研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格及试验方法3 缩 略语下列缩略语适用 于本标 准。3.1C P E致细胞 病变作用。3.2T C I D50半数细胞感染量。3.3F M D口蹄疫。原理 特异性的血清中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应
4、的免疫血清所中和，而且还表现在中和一定量的病毒，必须有一定效价的 免疫血清。本标准规定的中和试验是以 定量 病毒稀释血清为基础，当血清能阻止定量病毒 5 0%致细胞病变能力时，其血清的稀释度即为其效价。因而本中和试验是一种定量测定口蹄疫血清抗体的方法。5 试剂和材 料5.1 本标准所用水应符合 G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2中关于三级水(三蒸水)的规格。5.2 本标准所用试剂配方参见附录 Ae5.3 本标准试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。5.4 本标准所用试剂、玻璃器皿除有特殊规定外，均需高压灭菌。5.5 病毒选用经蚀斑法纯化并经血清学鉴定的 0,A,C,S A T i,S AT
5、 2,S A T。和 A s i a 1 型口蹄疫细胞毒分别作为各型血清抗体检测的标准毒。1S N/T 1 1 81.2-2 0 0 35.6 标准 血清:标准阴性血清采 用无口 蹄疫病毒抗体的 猪血清或牛血清，标准阳 性血清采用口 蹄疫病毒感染发病 2 1 d 的康复猪血清或牛血清。5.7 细胞系:I B-R s-2 或 B HK-2 1 细胞系。5.8 细 胞培养基:含 1 0%无口 蹄疫病毒抗体的胎牛血清(经5 6 C,3 0 m i n 灭能)及抗生素的细胞培养液。5.9 细胞维持液:含 2%无口蹄疫病毒抗体的胎牛血清(经 5 6 0C,3 0 m i n 灭能)及抗生素的细胞培养液。
6、5.1 0 细胞分散液。5.1 1 固定液的配制:1 0%甲醛(9 0 0 mL生理盐水+1 0 0 mL甲醛)。5.1 2边仍 液的配制.1 0 0 0 mL固宁液+0.5亚甲储6 器械和设备6.1 二氧化碳培养箱、微量振荡器、倒置显微镜、冰箱(-2 0 保存血清，-7 0 保存种毒)。6.2 1 0 0 mL细胞培养瓶、9 6 孔微量细胞培养板、吸头、多道可调移液器、单道可调移液器。预备试验7.1 将口蹄疫病毒 O,A,C,S AT,S A T,S AT,和 A s i a 1 型分别接种 I B-R s-2 或 B HK-2 1 细胞单层，3 7 吸附1 h 后加人维持液，置5%二氧化碳
7、培养箱于3 7 培养，接种2 4 h 后用倒置显微镜逐日 观察，待C P E 达7 5%以上，冻融一次或置水浴中 用超声波处理(4 0 u A,1 m in),2 0 0 0 r/m i n 离心2 0 m i n，上清液分装小瓶，每瓶 1 mL，置一7 0 保存备用。7.2 病毒毒价的测定及其工作浓度的配制:将病毒原液用细胞维持液做 1 0 倍系列稀释至 1 0-m，每个稀释 度作4 个孔，每孔5 0 I L L，每孔加5 0 A L细胞悬液(含1 0 个细胞/m L)，再补充细胞维持液5 0 p L.每块板设 4 孔正常细胞对照，于5%二氧化碳培养箱 3 7 培养，从4 8 h开始至 1
8、6 8 h用倒置显微镜逐日观察记录C P E按 K a r b e r 方法计算 T C I D s o。将病毒原液配制成 1 0 0 T C I D s o/5 0 p I，待用.7.3 将标准阳性血清、阴性血清、被检血清经 5 6 0 C 3 0 mi n 灭能，待用.7.4 将细晌用细响培养液稀释 成 1 0“个细胞/mL,待用中和试验81 对照设立8.1.1 细胞对照:设 4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液 5 0 p L(含 1 0 个细胞/m L)、细胞维持液1 0 0 p L o8.1.2 阳性对照:将已知滴度的标准阳性血清用细胞维持液在 9 6 孔微量培养板上从 1:4开始做对倍
9、系列 稀释，每 个稀释度作4 个孔，每孔加各稀释度阳性血清和1 0 0 T C I D so/5 0 p L 病毒悬液各5 0 K L,微量振 荡器振荡棍匀，置3 7 中和I h，再加人细胞悬液5 0 p L(含1 0,个细 胞/m L),8.1.3 阴性对照:设4 孔阴性血清对照，每孔加阴性血清和 1 0 0 T C I D s o/5 0 V L病毒悬液各5 0 p L，再加人细胞悬液 5 0 K L(含 1 0 个细胞/m L)e8.1.4病 毒 回 归 对 照:将 各 型 病 毒 稀 释 为1 0 0 6,1 0 0,1 0,1 T C ID so/5 0 p L，每 个 稀 释 度
10、作4 孔，每 孔 加人病毒悬液 5 0 p L，再加人细胞悬液 5 0 I.L(含 1 0 个细胞/m L)，每孑 L 补充细胞维持液 5 0 y L,8.1.5 血清毒性对照:被检血清每个稀释度设1 孔血清毒性对照，即5 0 川一 各稀释度血清，补充5 0 川维持 液，再加人细胞悬液5 0 p L(含1 0 个细胞/m L),8.2 试验步骤 将待检血清用细胞维持液在微量培养板上从 1，4开始做对倍系列稀释，每个稀释度作 5孔，每孔5 0 u L。被检样每个稀释度 4孔加人预备试验滴定好工作浓度的病毒悬液 1 0 0 T C I D s o/5 0 p L，微量振S N/T 1 1 8 1.
11、2-2 0 0 3荡器振荡 混匀，置3 7 中 和1 h，再加人细胞悬液5 0 y L(含1 0 个细胞/m L)。于含3%-5%二氧化碳的 培养箱中3 7 1C 培育2 d -3 d.4 8 h 用倒置显微镜初判，7 2 h 终 判，终判前需固定染色。8.3 终判定前的固定染色 弃去 培养基，每孔加5 0 K L固 定液，固 定3 0 m i n。弃去固 定液，将板浸人染色液中3 0 m i n。自 来水冲洗，观察结果，8.4 结果判定8.4.1 结果判 定需以 对照成立为前提，当病毒回 归为I g l.5-1 g 2.5，标准阳性血清效价与原滴定效价相差1 个滴度以内，参考阴性血清对照孔为
12、空白，细胞对照孔细胞染成蓝色时，才能进行终判。8.4.2 细胞层 染成蓝色的 孔判为阳性，细胞层为空白时判为阴 性。血清效价以5 0%终点血清与病毒混合液中血清的总稀释度表示。8.4.3 对试验结果的说明:由于实验室之间对终点的确定会有不同，或不同操作人员之间对病毒定量和血清稀释以及使用的试剂不同，因而常会造成试验结果的差异，所以各实验室可通过 OI E/F A O世界F MD参考实验室提供的标准试剂做参考来建立自己的标准。世界参考实验室的判定标准参见附录B.S N/T 1 1 8 1.2-2 0 0 3 附录A(资料性附录)溶液配方A.飞 细胞培养液的基本要求E a g l e s 最低要素
13、培养基H a n k s 液配 制的。.5%水解乳蛋白无口蹄疫病毒抗体的犊牛血清3%谷氨酞胺抗生素(参照A.2 选用)5%碳酸氢 钠(N a H C O,)调p H至7.2抽滤除菌4 4%4 4 Y o1 0%1%1%A.2 抗生素选用及工作浓度参考表(每毫升培养液含量)两性霉素 B制霉菌素庆大霉素卡那霉素新霉素青霉素G硫酸链霉素多黯菌素B 1.2 5 p g 1 0 0 I U 5 0 jag 5 0 p g 5 0 pg1 0 0 I U-2 0 0 I U1 0 0 p g-2 0 0 p g 1 0 0 I UA.3 细胞分散液胰酶乙二胺四乙酸二钠(E D T A)无钙镁P B S抽滤除菌 2.5 g 0.2 g0 0 0 M IS N/T 1 1 8 1.2-2 0 0 3 附录B (资料性附录)世界参考实验室判定标准 在5 0%终点，血清与 病毒混 合液中 血清的总 稀释度为1:4 5 或 1.4 5 以 上为阳性;1:1 6 至1:3 2为可 疑，应重新采血检测.重新采血检侧时，5 0%终点血 清与 病毒混合液中血 清的总 稀释 度大于 或等于1，1 6为阳性;1，8或1:8以下为阴性。