1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 2 4 7.1-2 0 0 3猪 繁 殖 和 呼 吸 综 合 征 间 接 免 疫 荧 光 试 验P r o t o c o l o f i n d i r e c t i mmu n o f l u o r e s c e n c e a s s a y f o rp o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e2 0 0 3-0 5-2 8 发布2 0 0 3-1 2-0 1 实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验
2、 检 疫 总 层S N/T 1 2 4 7.1-2 0 0 3前言 本标准 根据世界动 物卫生组织(O I E)(哺乳动物、禽和蜜蜂A和B 类疾病诊断试验和疫苗标准手册(第四版，2 0 0 的第三部分 X.1 2的内容编写。本标准的附录A、附录 B为规范性附录。本标准由国家认证 认可 监督管理委 员会提出并 归口。本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人:孙延峰、孙颖杰、苏永生、简中友、播凤城。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 2 4 7.1-2 0 0 3猪 繁 殖 和 呼 吸 综 合 征 间 接 免 疫 荧 光 试 验范围本标准规定了猪繁殖和呼
3、吸综合征的间 接免疫荧光试验诊断方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的诊断、流行病学调查、检疫和疫情监测。2 规范性引用文件 下列文件中的 条款通过本标准的引 用而成为本标准的 条款。凡是注日 期的引 用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准.然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法缩略语 下列缩略语适用于本标准。3.1 I F A 间接免疫荧光试验。3.2 F I T C 异硫袱酸荧光黄。3.3 P RR S 猪繁殖
4、和呼吸综合征。检验检疫4.1 原理 接免疫荧光试验是将抗原吸附于固相载 体上，抗原与抗体反应后，再用荧光素标记的抗抗体与其反应 形成抗原一 抗体一 抗抗体 复合物，在荧光显微镜 下可见荧光。本标准 是以9 6 孔板为载体，将接种猪繁殖和呼吸综合 征病毒的细 胞固 定于9 6 孔板上，依次加人被检血 清和 用F I T C 标记的兔抗猪抗体，反应结束后，置 荧光显 微镜下观 察结果。4.2采样 采集被检猪血液，分离血清，血清必须新 鲜透明 不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4 或一2 0 一3 0 冰箱 保存或冷藏条件下立即送检。试验 前将被检血清 统一编号。4.3 设备和材料4.3.1 仪器设备
5、 微量移液器;保湿盒;普通恒温箱及二氧化碳恒温箱;普通冰箱和低温冰箱;倒置显微镜;荧光显微镜;S N/T 1 2 4 7.1-2 0 0 3 量筒、烧杯等。4.3.2 材料和试剂 -MA R C-1 4 5 或H S 2 H细胞由国 家质检总 局认可的 单位提供;-P R R S 美洲标准株A T C C V R-2 3 3 2 或欧洲标准株 L V标准毒由国家质检总局认可的 单位 提供;-P R R S 病毒标准阳性血清和标准阴性血清由国 家质检总局认可的单位提 供;-F I T C 标记的 兔抗猪抗体由国 家质检总 局认可的 单位提供，-ME M营 养液(含1 0 0 0 犊牛 血清);-
6、P B S液(见附录 A);-E D T A-胰蛋白酶消化液(见附录 A);青霉素和链霉素;犊牛血清;-9 6 孔、4 8 孔细胞培养板和细胞培养瓶。4.4 I F A诊断板的制备 用E D T A-胰蛋白 酶消化液消化M A R C-1 4 5 或 H 孰H细胞，用ME M营养液 稀释成1 0，细胞/m L,加人P R R S标准毒(美洲标准株 A T C C V R-2 3 3 2或欧洲标准株 L V)，使其最终浓度为 1 0 0 T C I D,o/2 5 p L(T C I D s o 测定见附录B)，加到9 6 孔细胞培养板的1,3,5,7,9,1 1 列各孔内，每孔1 0 0 1+
7、L。在2,4;6,8,1 0,1 2 列各孔内加人未感染病毒细胞悬液 1 0 0 p L。将该细胞培养板置3 7 6,5%二氧化碳培养箱中 培养4 8 h-7 2 h，当细 胞出现2 0 写 C P E时，弃去培养液，每孔加人一 2 0 的 无水乙 醇1 0 0 K L(或8 0的丙酮溶液 1 0 0 k L,4 固定 3 0 mi n，弃掉丙酮溶液，置室温下风干)，置于一2 0 或一7 0 冰箱中备用。4.5 I F A试验4.5.1 取 I F A诊断板并编号，(如果用无水乙醉固定，弃去板中的无水乙醇，置超净工作台中风干)每孔加1 0 0 P L P B S 液 洗一次，弃去P B S 液
8、并倒置在吸水纸上轻轻拍干。4.5.2 在编号对应的孔内加人2 0 倍稀释的被检血清:同一排相邻的感染细胞孔一个及其后无感染细胞孔一个，每孔1 0 0 fi L，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用P B S 液代替血清，将反应板置保湿盒中，3 7 恒温箱中感作4 5 m i n,4.5.3 弃去板中液体，用 P B S液洗板四次，每孔 1 0 0 K L，每次 3 m i n，最后倒置在吸水纸上轻轻拍干。4.5.4 每孔加人工作 浓度F I T C 标记的 兔抗猪抗体5 0 k L，将反应板置 保湿盒中，在3 7 恒温箱中感作4 5 m i n,4.5.5 弃去板中液体，同4.5.3
9、 方法洗涤。46结果判定4.6，1 判定方法 荧光显微镜采用蓝紫光(滤板通常 用 B G,z，吸收滤板用O G，或G G,),5 倍 1 0 倍目 镜。4.6.2 判定标准 在所设对照都成立的情况下，即标准阳性血清对照中感染细胞孔应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔不应出现特异性荧光;标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔和未感染细胞孔均不应出现特异性荧光;被检血清对照中未感染细胞孔不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔出现特异性胞浆亮绿荧光的判为阳性;被检血清样品感染细胞孔未出现特异性胞浆亮绿荧光的判为阴性。S N/T 1 2 4 7.1-2 0 0 3 附录A (规范性附录)I F
10、A试验中试荆的配制本附录中 试验用水须符 合G B 6 6 8 2-1 9 9 2 的 要求。A.1 P B S液(0.0 1 m o l/L P B S,P H 7.2)抓化钠(N a C I)抓化钾(K C D磷酸氢二钠(Na t HP O,)磷酸二氢钾(K H z P O,)二级水加至 8g0.2 g1.1 5 g0.2 g0 0 0 m L分装后保存于4 备用。保存期3 0 天。A.2 E D T A-胰蛋白酶消化液 胰蛋白酶(1，2 5 0)0.5 g 乙二胺四乙酸二钠(E DT A)。2g 氛化钠(Na C I)8 g 氯化钾(KC 1)0.4 g 葡萄糖1.0 g 碳酸氢钠(N
11、a H C O,)0.5 8 g 青霉素2 X 1 0 5 I U 一 链霉素1 0 0 m g 一 酚 红。.0 2 g 二级水加至1 O O O m L0.2 2 p m滤膜过滤除菌后分装，保存于一2 0 备用。保存期一年。S N/T 1 2 4 7.1-2 0 0 3 附录B (规范性附录)猪繁殖和呼吸综合征病毒 T C I D s o 测定B.1 稀释病毒 取洁净无菌的4 8 孔细胞培养板，于第一孔加M E M营养液2 0 0 p L，其余各孔加2 2 5 K L;换吸头，再于排头第一孔添加病毒液5 0 K L，将混合液充分混匀。换吸头，吸取2 5 u L 移于第二孔，混合。更换吸头，
12、再吸 取2 5 K L加人第三孔。连续如此操作至第1 0 列，作成1 0 个连续1 0 倍的 稀释液，使病毒稀释度依次为5 X 1 0 0,5 X1 0 ,5 X 1 0,5 X1 0 ,5 X1 0 ,5 X 1 0 ,5 X l O ,5 X I O ,5 X 1 0 ,5 X 1 0 .用微量移液器吸取每一稀释度的病毒液 5 0 K L移人另一块 9 6 孔细胞培养板，每个稀释度的病毒液平行接种四孔。剩下的各孔加 5 0 p L ME M营养液，留作细胞对照。B.2添加细胞 MAR C-1 4 5 或 H S T H细胞经细胞分散液分散消化后计数，用ME M 营养液稀释至2 X1 0 5
13、 细胞/mL的细胞悬液，于细胞培养板 各孔内添加5 0 p L。此时，病毒稀释度依次变为1 0 ,1 0 1,1 0 3,1 0 ,1 0 5,1 0 6,1 0 ,1 0 8,1 0 ,1 0 eB。3 培养封板后，放 3 7 0 C 5%二氧化碳保湿恒温箱内培养。B.4观察与 T CI D6。计算 在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用(C P E)。每天观察一次，并将观察结果记人专用登记表内。观察天数为直至出现 C P E终点，即看到能够引起病毒增殖的病毒最高稀释度。对照细胞应始终保持良好形态和特征。最后，用 R e e d-Mu e n c h法或Ka r b e r 法计算该病毒培养物的T C I D s o/m L.