1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 4 3 9-2 0 0 4国境口岸埃博拉出血热检验规程E x a m i n a t i o n c o d e s f o r e b o l a h e m o r r h a g i c f e v e r a t f r o n t i e r p o r t2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施中华人民共和匡国家 质 量 监督 检 验 检 疫 总 I FRS N/T 1 4 3 9-2 0 0 4月U青 本标准的附录C、附录 D为规范性附录，附录A、附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督
2、管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人 民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人:黄廷学、黄健民、关淳、吴波、黄春德。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N/T 1 4 3 9-2 0 0 4国境口岸埃博拉出血热检验规程范 围本标准规定了国境口岸埃博拉出血热的检验对象、方法、结果报告程序及阳性结果的处置原则。本标准适用于国境口岸的埃博拉出血热实验室检验。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2.1 埃 博拉出 血热 e b o l a h e m o r r h a g ic f e v e r 由埃博拉病毒引起的一种对人类生命健
3、康威胁极大的烈性传染病。主要通过与病人及其排泄物等接 触传染，也可通过气溶胶传播。对象在人境人员中发现的埃博拉出血热染疫人及染疫嫌疑人。灵长类动物(来自 埃博拉出血热地区)。人体组织和器官(来 自 埃博拉出血热地区)。33.1找4标本的采集和处理4.1 病人血清 早期病人血液标本(在发病3d内)及第二次血液标本(在 3 周后)采集，冷藏条件下迅速送实验室，当日分离血清。如不能立即做细胞培养，血液标本应放人超低温冰箱(-8 0 C)或液氮罐内保存。4.2 病人体液、排泄物 采集病人体液、排泄物(包括尿液，精液，阴道、直肠、鼻腔、口腔、眼结膜分泌物)等在冷藏条件下迅速送至指定实验室，做病毒分离或其
4、他检测用。4.3 组织标本 采集死亡病例(灵长类动物)含有汗腺的皮下组织、肝脏、脾脏等，在冷藏条件下迅速送至指定实验室，做病毒分离或其他检测用4.4 标本标识与实验样品转运4.4.1 标本标识 采集的标本应进行标识，连同相关记录一并送实验室4.4.2 实验样品转运 实验样品转运过程应遵循下列原则:所有需要转运的实验样品必须标明“传染性物质，埃博拉病毒”;短途运输必须使用专车，由专人运送。尽可能避免长途转运，如确需要空运的实验样品应按照 有关部 门对传染性物品运输 的规定办理;样品的容器要使用能够承受不少于 9 5 k P a 压力的高质量的防水包装材料并且密封，以防止运 输过程中发生内容物的外
5、泄;第二层和第三层包装中应使用吸水性好的柔软物质充填;S N/T 1 4 3 9-2 0 0 4几个易碎的容器在同一个包裹中运输时，应分别独立包装并相互隔离，以免相互碰撞。准备常用仪器设备和器材参见附录 A，常用溶液及配制参见附录B,检验方 法 埃博拉出血热实验室的检验方法如下:电子显微镜检查;埃博拉病毒抗原检测;病毒分离鉴定;病毒核酸分子检测;特异性抗体检测。检验方法的详细内容遵照附录 C,根据实验室设备条件及技术力量，选择使用上述检验方法，但其中应包括病毒学检验和抗体检测方法中一项至两项。生物安全及防护措施埃博拉出血热实验室的生物安全及防护措施按照附录D的规定操作。检验结果报告8.1 电子
6、显微镜检查 电镜法检查阳性，报告为“检出丝状病毒颗粒”，应采用免疫电镜技术做进一步鉴定。8.2埃博拉病毒抗原检测 双抗体夹心抗原捕获 E L I S A法对(血液、尿液、及皮下组织悬液)标本检测阳性，报告为“埃博拉病毒抗原阳性”。8.3 病毒分离鉴定 将含病毒材料接种细胞培养，出现明显细胞病变，并经间接免疫荧光法(U F A)鉴定证实，报告为“检出埃博拉病毒”，可以确诊。8.4 病毒核酸分子检测 用反转录一 聚合酶链反应(R T-P C R)法从(病人或病兽标本)中检测到埃博拉病毒特异性 G P基因，报告为“检出埃博拉病毒特异性G P基因”，可以确诊。8.5 单份血清检测 单份血清标本特异性
7、坛M抗体 1，4 0以上，报告为“埃博拉病毒 坛M抗体阳性”，结合临床表现具有诊断意义。8.6 双份血清检测 患者双份血清特异性抗体检测，恢复期血清抗体效价较急性期增高四倍及以上时，报告为“埃博拉病毒抗体阳性”，可以确诊。8.7间接免疫荧光试验(I F A)单份血清标本 1:6 4 稀释呈阳性或双份血清效价增高四倍及以上时，报告经间接免疫荧光试验证实为“埃博拉病毒抗体阳性”，可以确诊.8.8 免疫印迹试验(I B T)待检血清标本经免疫印迹试验同时出现NP和V P 3 0或NP和 V P 2 4显色区带，报告为“埃博拉病毒抗体阳性”，可以确诊。S N/T 1 4 3 9-2 0 0 49 阳性
8、结果的处t 对病毒分离株及其他阳性结果的相应标本应送有资质的实验室做复检或鉴定。阳性结果应及时向上级主管部门报告。S N/T 1 4 3 9-2 0 0 4 附录A (资料性附录)常用实验设备和器材A.1 实验设备 按照国际标准建设，并经相关部门组织专家全面验收合格的生物安全防护四级(B S L-4或 P 4)实验室和相应的配套设施，以及严格的工作规章制度。A.2A.2.1A.2.2A.2.3A.2.4A.2.5A.2.6A.2.7A.2.8主要仪器 透射式电镜(放大2 0 万倍)和超薄切片机、真空喷镀仪等。落射式荧光显微镜、倒置显微镜。低温超速离心机(1 0 0 0 0 0 g),超低温冰箱
9、(一8 0,C)、液氮储存罐。Y-射线照射装置。P C R检测仪。双门高压灭菌器、熏蒸消毒柜。电泳仪及垂直平板电泳槽、转移电泳槽、透射反射仪等。A.3细胞 培养用器 材A.3.1A.3.2A.3.3A.3.4A.3.5A.3.6A.3.7A.3.8A.3.9A.4 一次性无菌有盖塑料细胞培养瓶(2 5 c m ).二氧化碳恒温培养箱，3 7 恒温培养箱(内置细胞瓶旋动培养装置)。一次性微孔滤膜滤菌器。负压抽滤瓶及电动真空泵。电渗析一 离子交换纯水器、石英玻璃重(双)蒸馏器。普通冰箱(o 0 C 一2 0 0C),电热干烤箱、高压蒸汽灭菌器。1 0 K L-1 0 0 p L,1 0 0 f-L
10、 -1 0 0 0 p L 可调式微量 加样器及塑料尖吸头。玻璃吸管、量筒、三角烧瓶。血清学试验用主要器材A.4.1 9 6 孔微量滴定板。A.4.2 2 5 1 L,5 0 t L,1 0 0 t L 定量加样器及塑料尖吸头。A.4.3 微型混合器、涡旋振荡器。A.4.4 3 7 及 5 6 水浴箱。A.4.5 电动离心机(4 0 0 0 r/mi n).A.4.6 普通冰箱。A.4.7 酶标检测仪、洗板机。A.4.8 低温(-2 0 0C)冷冻切片机。A.4.9 镀膜多孔(8 孔1 0孔)载玻片(制备抗原片用)等。A.5 动物实验用器材 目前细胞培养法虽已成功地取代动物接种，应用于埃博拉病
11、毒的分离与鉴定。但仍须准备对留验S N/T 1 4 3 9-2 0 0 4的可疑染病或死亡动物进行采血、解剖取材送检。所需的常用器材包括:一次性无菌的5 m L-1 0 mL注射器和针头;无菌的动物解剖用器械，动物解剖台;盛有E D T A抗凝剂的有塞无菌试管、无菌的组织容器及低温(C O:干冰)冷藏送检装置;病兽留验隔离观察的饲养笼具，专用的病死动物尸体焚化炉.S N/T 1 4 3 9-2 0 0 4 附录B(资料性附录)常用溶液及配制B1 细胞培养常用溶液B.1.1 基础营养液 E a g l e 最低需要培养液(简称E M E M),G i b c o 公司生产，按产品说明书称取一定量
12、干燥试剂用新鲜双蒸馏水配制。过滤除菌，小瓶分装，4 C贮存备用。B.1.2 完全培养液 根据需要取 E ME M基础营养液再添加5%-1 0%胎牛血清(F C S)或新生小牛血清(N C S),(注:细胞营养维持液只需加人 2%F C S或 N C S)。青霉素 1 0 0 I U/mL，链霉素 1 0 0 p g/mL及庆大霉素5 0 y g/m L;并用5%碳酸氢钠调节至p H 7.2-p H 7.4,B.1.3小牛血清 无菌的优质新鲜胎牛血清或新生小牛血清，不含有支原体及其他细胞毒性物质，分装灭后活备用。B.1.4 Ha n k s 平衡盐溶液(简称 H B S S)B.1.4.1 Ha
13、 n k s液(2 0X):母液甲(2 0 X)成分 Na C l 1 6 0 g,K C I 8.0 g,Mg S O,7 H,0 2.0 g,Mg C I,6 H 2 0 2.0 g C a C 1 2 2.8 g 母液乙(2 0 X)成分 Na z HP q 1 2 H,O 3.0 4 g,K H P 认 1.2 0 g,葡萄糖 2 0.0 0 g 2 g/L的酚红溶液 1 0 0 mL 配法:首先将母液甲各成分逐一溶解于8 0 0 mL去离子水中，将C a C I:单独溶解于 5 0 mL去离子水后缓慢加人混匀，用水补充至 1 0 0 0 m L;将母液乙各成分溶解于 8 0 0 mL
14、去离子水，再加人酚红溶液，混匀后用去离子水补充至 1 0 0 0 mL;并在两液中各加三抓甲烷 2 m L作为防腐剂，塞好瓶塞，置4 冰箱保存。B.1.4.2 Ha n k s应用液(l x)配法:取母液甲和母液乙各一份，加人去离子水 1 8份，分装后塞好瓶塞，1 1 5 高压蒸汽灭菌1 5 m i n，置室温或4 冰箱保 存，可使用一个月。临 用时 用5 纬 N a H C O,调至所需的p H值。B.1.5 抗生素贮存液 用无菌注射用水或 Ha n k s 液配制每毫升内含青霉素 1 0 0 0 0 I U,链霉素 1 0 0 0 0 la g及庆大霉素5 0 0 0 p g 的抗生素贮存
15、液。分装小瓶(2 mL/瓶)，一2 0 冷冻保存。使用时按 1%量加人完全培养液内。B.1.6 细胞消化液 成分:胰酶0.2 5 g,Ha n k s 液 1 0 0 m L，抗生素贮存液 I mL 配法:将胰蛋白酶溶解于 H a n k s 液，加人抗生素，过滤除菌，分装小瓶，-2 0 冷冻保存。每次按需用量取用，不能反复冻融。B.2 血清学试验用溶液和试荆B.2.1 硼酸盐缓冲液(p H 9.0,0.0 5 m o l/L)母液甲(0.5 m o l/L N a C l 液),N a C l 8 7.6 8 g，去 离子水 加至1 0 0 0 m L.sS N/T 1 4 3 9-2 0
16、0 4 母液乙(0.5 mo l/L硼酸);H,B 认 3 0.9 2 g，去离子水加至 1 0 0 0 m L.母液丙(1 m o l/L N a OH溶液),N a OH 4 0 g，去离子水加至 1 0 0 0 mL.配制法:取母液甲8 0 mL，母液乙 1 0 0 mL，母液丙2 4 mL，去离子水加至 1 0 0 0 mL.B.2.2 磷酸盐缓冲盐水(p H 7.4,0.0 1 m o l/L，简称P B S)称取Na z H P O,1 2 Hz 0 2.9 g,N a H,P O,2 H2 0 0.3 g，及 Na C l 8.5 g，用去离子水溶解至1 0 0 0 mL.高压蒸汽 1 1 5 灭菌 1 5 m i n-2 0 mi n 后备用。B.2.3洗液(P B S-T,E LI S A试验用)0.0 1 m o l/L,p H 7.4 P B S 内含0.0 5 写 吐温-2 0.B.2.4 封闭液B.2.4.1 供E L I S A试验用 称取去脂奶粉(B a c t o s k i m m i l k,D i f c o)5 g溶于 1 0 0 mL P B