1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?国境口岸球孢子菌检测方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：熊焕昌、李庶甘、张毅、林青、苏水宽、顾大勇、杨坤宇。犛 犖犜 国境口岸球孢子菌检测方法范围本标准规定了国境口岸球孢子菌的病原学检验、酶联免疫吸附试验、实时荧光定量 检测球孢子菌核酸的实验室检测方法。本标准适用于国境口岸球孢子菌的实验室检验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少
2、的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求 入出境特殊物品处理规程 危险物品安全航空运输技术细则（年 年）术语和定义下列术语和定义适用本文件。球孢子菌犆 狅 犮 犮 犻 犱 犻 狅 犻 犱 犲 狊 犻 犿犿 犻 狋 犻 狊球孢子菌为双相型真菌，在组织内形成小球体，亦称孢子囊，产生内生孢子，为孢子型；在室温或自然界则形成丝状分隔菌丝体，产生关节孢子，为关节菌丝型，两者在一定条件下可互相转化。关节孢子具有高度传染性。在沙氏琼脂培养基上室温 条件下培养为霉菌相，菌落形态、质地和颜色多变，而在组织中或
3、 的富集培养基中以酵母或球形方式生长。球孢子菌病犆 狅 犮 犮 犻 犱 犻 狅 犻 犱 狅 犿 狔 犮 狅 狊 犻 狊球孢子菌病由吸入球孢子菌引起的肺或其他器官的真菌病。可为原发或继发，原发性感染以肺部最为常见，间或见于皮肤，症状轻，病程短，常自愈；少数免疫力低下或再吸入大量孢子者，不但肺部症状加重，而且可播散至脑膜、骨骼和皮肤等处，愈后不佳，临床上主要以肺和淋巴结的脓性肉芽肿为特征。检验对象 来自流行区的入出境人员，申请检验的其他人员。怀疑可能被球孢子菌污染的入出境特殊物品。国境口岸可疑球孢子菌病人和球孢子菌感染者的尸体等。犛 犖犜 检验程序 标本的采集、运送 来自球孢子菌病流行区的人员、申
4、请检验的其他人员以及国境口岸可疑球孢子菌病人，采血液、尿液、胸腔积液、新鲜痰液、脑脊液或皮肤碎片等。怀疑死于球孢子菌感染的尸体，采胸腔积液、肺组织、脑和神经等组织。怀疑可能被球孢子菌污染的入出境特殊物品的采集按照 规定进行。标本或活菌培养物运输应按国际民用航空组织 中类传染性物质的要求。实验室生物安全及消毒措施 实验室生物安全符合 的规定。直接镜检涂片制作及染色、样本前期处理均应在级生物安全柜内进行。标本检测，包括样本的病原菌直接镜检、酶联免疫吸附试验（）、实时荧光定量 检测等初步检测，在生物安全二级（）实验室进行。大量活菌操作，在生物安全三级（）实验室进行。实验完毕后所有可用高压消毒的物品均
5、应在实验室内进行高压消毒；不能用高压消毒的物品及实验台面和污染的设备表面用有效的消毒剂消毒；实验室用紫外灯消毒。实验室仪器设备实验室设备配置根据不同检验方法来选择，见附录、附录、附录、附录。实验室检测方法 病原学检验直接涂片检查见附录；分离培养、血清学鉴定见附录。免疫学检验 见附录。核酸检测实时荧光定量 检测球孢子菌核酸方法见附录。结果判定和报告 样本的直接镜检观察到酵母样细胞或菌丝，报告需描述观察所见结果，如“样本荧光白染色可见酵母样细胞，有内生球体”、“样本荧光白染色可见酵母样细胞，未见内生球体”、“样本荧光白染色可见菌丝样细胞”。直接镜检未观察到酵母样细胞或菌丝，应报告“样本荧光白染色未
6、见酵母样细胞或菌丝样细胞”。分离培养阳性，且至少与抗、抗、抗血清中的一种凝集（、为球孢菌特异菌表面抗原物质），报告“检出球孢子菌”；分离培养阳性，且与抗、抗、抗血清均未凝集，报告“检出双相型真菌（非球孢子菌）”；分离培养八周无菌落生长为阴性，报告“培养八周未见菌落生长”。用 方法从样本中检测到球孢子菌 或 抗体，判定为球孢子菌 或 结果阳性。报告为“样本 法检测球孢子菌 阳性，阳性”或“样本 法检测球孢子菌犛 犖犜 阳性，阴性”或“样本 法检测球孢子菌 阴性，阳性”。如果两者均未检测到，则报告“样本 法检测球孢子菌 阴性，阴性”。样本用 检测到球孢子菌基因，判定为球孢子菌 检测结果阳性，报告为
7、“样本经实时荧光定量 检测，检出特异球孢子菌核酸片段”。如果用 未检测到球孢子菌基因，判定为球孢子菌 检测结果阴性，报告为“样本经实时荧光定量 检测，未检出特异球孢子菌核酸片段”。阳性结果的处置：对检测阳性标本应送上一级实验室（或指定的实验室）做复检或鉴定。阳性结果应按规定向上级主管部门报告。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）球孢子菌直接镜检方法犃 材料准备犃 仪器设备犃 离心机。犃 级生物安全柜。犃 荧光显微镜。犃 试剂犃 氢氧化钾犃 荧光白溶液荧光白 偶氮蓝 蒸馏水 犃 应用液 氢氧化钾 荧光白溶液 犃 直接镜检方法样本的直接镜检可以对球孢子菌的诊断提供快速的检测。取 新鲜痰液、脑脊液、尿液于
8、载玻片上，滴加 应用液染色 ；皮肤碎片、组织涂片和类似标本 于载玻片上，滴加 应用液染色 ，加上盖玻片，用荧光显微镜放大 倍 倍进行观察，观察是否存在酵母样细胞或菌丝。球孢子菌的成熟球体是厚壁，一般直径 ，大的球体直径可达，内生孢子（）在压碎的球体中能够观察到；未成熟或小的球体（直径 ）缺乏内生孢子，成熟球体破裂释放内生孢子。菌丝可在胸腔积液、脑脊液等中观察到。犃 结果判定样本直接镜检观察到酵母样细胞或菌丝，报告需描述观察所见结果，如“样本荧光白染色可见酵母样细胞，有内生球体”、“样本荧光白染色可见酵母样细胞，未见内生球体”、“样本荧光白染色可见菌丝样细胞”。直接镜检未观察到酵母样细胞或菌丝，
9、应报告“样本荧光白染色未见酵母样细胞或菌丝样细胞”。犛 犖犜 附录犅（规范性附录）球孢子菌的分离培养犅 材料准备犅 仪器设备犅 恒温培养箱（和）。犅 显微镜。犅 高压灭菌器。犅 普通冰箱（）。犅 离心机。犅 全排式生物安全柜。犅 水浴锅。犅 无菌试管（，）。犅 无菌培养皿（直径）。犅 玻璃器皿、接种工具。犅 试剂犅 沙氏琼脂培养基（犛 犇 犃）犅 组成葡萄糖 蛋白胨 琼脂 蒸馏水 犅 制法 各组分混合后 灭菌，冷却至 左右加入庆大霉素 、放线菌酮 ，混匀，分装试管（），每管加培养基，置斜面；倾注平板，每皿 。冷却后备用。犅 脑心浸汁培养基（犅 犎 犾）犅 组成脑心浸膏 琼脂 蒸馏水 犅 制法
10、各组分混合后，灭菌后冷却至 左右，分装试管（），每管加培养基，置斜面，冷却后备用。不加琼脂为液体培养基。倾注平板，每皿 。冷却后备用。犛 犖犜 犅 氯化钠溶液犅 组成氯化钠 蒸馏水 犅 制法 各组分混合后，灭菌后冷却至 左右，分装试管（），每管加溶液，冷却后备用。犅 抗犎 犛血清、抗犉血清、抗犎 犔血清（犎 犛、犎 犔、犉为球孢菌特异菌表面抗原物质）由有资质的机构提供。犅 分离培养犅 分离接种取 血液 犵离心 后，分别取 中间层划线接种沙氏琼脂培养基（）斜面和平板各一个；另分别取 中间层划线接种脑心浸汁培养基（）斜面和平板各一个。尿液、胸腔积液、新鲜痰液或脑脊液等其他标本直接分别取 划线接种沙
11、氏琼脂培养基（）斜面和平板各一个；另分别取 划线接种脑心浸汁培养基（）斜面和平板各一个。犅 沙氏琼脂培养基（犛 犇 犃）培养接种了样本的沙氏琼脂培养基（）斜面和平板，置于恒温培养箱 培养，观察是否有呈霉菌相特征菌落生长。球孢子菌菌落生长慢，一周内形成具有分生节孢子的有隔菌丝和透明的具丛卷毛状的菌落，菌落的色泽和质地多样性，颜色由浅黄到黄到灰色，质地卷毛状到粉状，分离出单菌落后作血清学鉴定。球孢子菌的分生孢子初期生长在菌丝的侧枝上，呈厚壁的琵琶桶状，约（）（）。两个孢子之间有空的间隔的薄壁细胞。阴性培养观察八周。犅 脑心浸汁培养基（犅 犎 犐）培养接种了样本的脑心浸汁培养基（）斜面和平板，置于恒
12、温培养箱 培养，观察是否有呈酵母相特征菌落生长。约四周可见直径的圆形、隆起、光滑、湿润、乳酪样酵母菌落，分离出单菌落后作血清学鉴定。镜下球孢子菌的形态特征与直接涂片镜检相同。阴性培养观察八周。犅 血清学鉴定用接种环挑取单菌落，置于装有 的氯化钠溶液的试管（）制成菌悬液。用蜡笔在一张玻片上划出三个间隔和一个对照间隔。在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并分别滴加一滴相当的抗 血清、抗血清、抗血清。在对照间隔内加一滴氯化钠溶液。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片 。阳性凝集反应可以立即观察到。犅 结果判定分离培养出双相型真菌，且符合 和 的菌落特征及镜下形态特征为阳性。分离培养阳性，且至少与抗
13、、抗、抗血清中的一种凝集的，报告“检出球孢子菌”；分离培养阳性，且与抗、抗、抗血清均未凝集，报告“检出双相型真菌（非球孢子菌）”；分离培养八周无菌落生长为阴性，报告“培养八周末见菌落生长”。犛 犖犜 附录犆（规范性附录）犈 犔 犐 犛 犃法检测抗球孢子菌犐 犵 犕或犐 犵 犌犆 材料准备犆 仪器设备犆 酶标仪（带 波长）。犆 洗板机。犆 普通冰箱（）。犆 计。犆 可调移液器（，）。犆 试剂犆 包被稀释液（碳酸钠碳酸氢钠缓冲液，）：碳酸钠 碳酸氢钠 叠氮钠 双蒸水 ，调 。犆 封闭液（小牛血清 溶液）：小牛血清 （）。犆 冼涤液（，）：氯化钠 磷酸二氢钾 十二水磷酸氢二钠 氯化钾 硫柳汞 吐温
14、双蒸水 ，调 。犆 样本稀释液（，）：氯化钠 磷酸二氢钾 十二水磷酸氢二钠 氯化钾 硫柳汞 双蒸水 ，调 。犆 显色液（过氧化氢尿素溶液）：犆 底物液（、四甲基联苯胺，）：犛 犖犜 无水乙醇 双蒸水至 犆 底物液缓冲液（柠檬酸 磷酸氢二钠缓冲液，）：磷酸氢二钠 柠檬酸 过氧化氢尿素 三蒸水 ，调 犆 将底物液和底物液按混合即成显色液（过氧化氢尿素应用液）。犆 终止液（硫酸溶液）：双蒸水 ，浓硫酸 （缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至 。犆 羊抗人 或羊抗人 ，由有资质的机构提供。犆 标记的球孢子菌（）单克隆抗体，由有资质的机构提供。犆 标准抗原，由有资质的机构提供。犆 标准阳性血清，由有资质的机
15、构提供。犆 标准阴性血清，由有资质的机构提供。犆 犈 犔 犾 犛 犃检测犐 犵 犕或犐 犵 犌犆 羊抗人 或羊抗人 用包被稀释液稀释至要求浓度（），在 孔酶标板上加入 孔，包被过夜。包被好的酶标板于保存，内稳定有效。犆 倾去酶标板中溶液，用洗涤液洗板，孔 孔，洗次次。犆 加入封闭液，封闭。犆 重复步骤 。犆 待检血清、标准阳性血清和 标准阴性血清用样本稀释液稀释至 ，待检脑脊液稀释至后，孔，孵育。犆 重复步骤 。犆 加入用样本稀释液稀释好的 标准抗原，孔，过夜。犆 重复步骤 。犆 加入用样本稀释液稀释好的 标记的 单克隆抗体，孔，孵育。犆 重复步骤。犆 每孔加入显色液 ，显色 。犆 每孔加入终
16、止液 终止反应。犆 在 内用酶标仪在 波长测量每孔的 值。犆 结果判定犆 阳性血清 值与阴性血清 值的比值大于或等于，试验成功，试验结果成立的条件下方能判定样品的结果，否则，试验结果不成功，查找原因，并重做试验。犆 待检样品的 值与阴性血清 值的比值，判定为 或 捕捉 阳性。犆 待检样品的 值与阴性血清 值的比值，判定为 或 捕捉 阴性。犆 待检样品的 值与阴性血清 值的比值在 ，判定为 或 捕捉 弱阳性。犆 说明可采用等效的 或 捕捉 试剂盒进行检测，其操作和结果判定根据试剂盒的说明书进行。犛 犖犜 附录犇（规范性附录）实时荧光定量犘 犆 犚检测球孢子菌核酸犇 材料准备犇 仪器设备犇 离心机。犇 研磨器或研钵。犇 恒温混合器。犇 实时荧光定量 检测仪。犇 可调移液器（，）。犇 引物和探针犇 基因扩增引物上游引物：下游引物：犇 探针 （标记 ）（标记 ）犇 试剂犇 提取试剂（）。试剂盒组分 磁珠 裂解液 磁珠结合液 洗液一 洗液二 洗液三 洗脱液 犇 缓冲液 （）犇 蛋白酶配制浓度 。犇 （）。）是由德国（）公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产