1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 李痘病毒检疫鉴定方法犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犘 犾 狌 犿狆 狅 狓狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书前言本标准的附录为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈定虎、王章根、李明福、胡学难、李桂芬、王秀芬、冯黎霞、管维。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛
2、犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售李痘病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了李痘病毒检疫和鉴定的基本原则和方法。本标准适用于带有李痘病毒的所有进出境的无性繁殖材料、组培苗、种子和果实的检疫鉴定。原理李痘病毒学名：（），别名：，是核果类果树危险性最大的病毒之一，其外壳蛋白的特异性和核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、地理分布、寄主范围和症状、传播途径、血清学特性及基因组特征等参见附录。仪器设备、用具及试剂 仪器设备 酶标检测仪。扩增仪。电泳仪。台式高速冷冻离心机。凝胶成像系统。电子分析天平。用具 移液器（，）。研钵。、离心管。酶联板。犈 犔 犐 犛 犃检测试剂 包被缓冲液
3、犿 犔（狆 犎 ）碳酸钠（）碳酸氢钠（）叠氮化钠（）溶于 蒸馏水中，溶液的 为，不需要调 值。犘 犅 犛缓冲液 犿 犔（狆 犎 ）氯化钠（）磷酸二氢钾（）磷酸氢二钠（）氯化钾（）叠氮化钠（）用无菌水溶解并定容至 。样品抽提缓冲液 犿 犔二乙基碳酰二胺（）犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售用 缓冲液（）溶解并定容至 。洗涤缓冲液 犿 犔吐温 缓冲液 无菌水 叠氮化钠（）抗体稀释缓冲液 缓冲液 牛血清白蛋白（）底物缓冲液（狆 犎 ）犿 犔二乙醇胺 加蒸馏水 叠氮化钠（）用盐酸（）调 至，然后定容至 。底物溶液在底物缓冲液中加入碱性磷酸酶的底物对硝基苯磷酸钠（狆 ，），浓度为 。犘 犆 犚
4、检测试剂 犚 犖 犃抽提缓冲液 ，巯基乙醇 犜 犈缓冲液 ，犜 犃 犈缓冲液 ，加样缓冲液溴酚蓝 引物合成根据已报道的 以及其株系和株系的保守序列设计通用和特异性引物：通用引物：特异性引物：株系：株系：犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售检验方法 症状检查要仔细检查李属科植物叶片及其花、果实及种子是否有畸形、环斑、斑驳等可疑症状并采集可疑症状的样品。血清学检测对采集的植物样品采用三抗夹心免疫吸附测定法（）进行检测。）采取 表现可疑症状的植物组织，同时用 健康组织和组织提取缓冲液作为阴性对照，加入 样品抽提缓冲液研磨制成待测样品液；）用包被缓冲液按要求稀释多克隆兔抗 抗体，然后在酶联板的
5、加样孔中加入 该稀释抗体，保温；）然后用洗涤缓冲液洗涤酶联板次，每孔加入洗涤缓冲液 ，每次 ；）取待测样品液 加入酶联板的加样孔中（以健康组织和植物组织抽提缓冲液作为阴性对照），保温过夜（约）；）用洗涤缓冲液洗涤酶联板次，每孔加入洗涤缓冲液 ，每次 ；）每孔加入 合适稀释的第二抗体（单克隆 抗体），孵育；）用洗涤缓冲液洗涤酶联板次，每孔加入洗涤缓冲液 ，每次 ；）每孔加入 合适稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体，孵育；）用洗涤缓冲液洗涤酶联板次，每孔加入洗涤缓冲液 ，每次 ；）每孔加入新配制的底物溶液，然后在不同的时间分别测定它们的 吸收值。植物组织总犚 犖 犃提取 选取 表现可疑症状的植物组织
6、，同时用 健康组织作为对照。将植物组织加液氮冷冻后充分研磨后装入 离心管中。在离心管中加入冰冷的 抽提液，颠倒混合均匀。台式冷冻离心机 犵离心 。取上清液，加入 苯酚三氯甲烷异戊醇（，体积比），颠倒混合均匀。台式冷冻离心机 犵离心 。取上清液，加入 三氯甲烷异戊醇（，体积比），颠倒混合均匀。台式冷冻离心机 犵离心 。取上清液，加入 无水乙醇和 醋酸钠 ，颠倒混合均匀。台式冷冻离心机 犵离心 。留沉淀，用 冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于 无 酶的水中。犚 犜 犘 犆 犚检测 ：在 离心管中加入去离子水，加入总，（）（），（），水浴 后立即置于冰上 ；然后 离心；再加入 第一链合成
7、缓冲液，；抑制剂（）；反转录酶（）；。扩增：在 离心管中加入 扩增缓冲液，氯化镁（），（），（），（）或（）或（），第一链合成反应液，加水至，然后加入犜 犪 狇聚合酶（）。循环条件：变性 ；然后 ，循环 次；最后 延伸 ；保存反应产物。以健康植株总核酸和无菌水为阴性对照，为阳性对照。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 琼脂糖电泳 用 缓冲液和琼脂糖按 的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至 左右。加入?核酸染料或溴化乙锭（），混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的 缓冲液（缓冲液没过凝胶上表面约）。取加样缓冲液与 反应液混合均匀，然后分别将其和合适的
8、 分子量标准物加入样品孔中。接通电源进行电泳，电压。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离 片段时，停止电泳。将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照相记录。结果判断 血清学结果判断 对照孔的 值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的 值小于 ，当阴性对照孔的 值小于 时，按 计算；阳性对照 值阴性对照 值大于。在满足了 质量要求后，结果判断如下：样品 值阴性对照 值大于等于，判为阳性；样品 值阴性对照 值小于，判为阴性。若满足不了 质量要求，则不能进行结果判断。如果是商品试剂盒，则根据试剂盒的说明来判断。犘 犆 犚结果判断 当琼脂糖电泳时，如果阳性对照
9、和待测样品都出现 特异性条带而阴性对照没有该条带，即可判定该样品带有李痘病毒，否则不带有李痘病毒。对于带有李痘病毒的样品，如果用 和 二引物扩增出 条带，则说明该李痘病毒为株系；当用 和扩增出 条带，则说明该李痘病毒为株系。样品保存与复核 样品保存检测为阳性的植物样品，经液氮冷冻后，于 下保存。保存样品做好登记和标记工作。结果记录与资料保存包括：样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员的签字。要有实验数据结果，要有电泳检测阳性结果照片。复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责，主要考察实验原始数据记录及其电泳照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验
10、。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犃（资料性附录）李痘病毒介绍犃 李痘病毒分类地位马铃薯病毒科（），马铃薯病毒属（犘 狅 狋 狔 狏 犻 狉 狌 狊）。犃 地理分布保加利亚、罗马尼亚、阿尔巴尼亚、塞浦路斯、法国、德国、希腊、匈牙利、意大利、卢森堡、波兰、葡萄牙、西班牙、叙利亚、土耳其、英国、俄罗斯、埃及、智利及美国、加拿大、澳大利亚等国家。犃 寄主范围 能侵染木本科和草本科寄主。李属植物是其自然寄主，最主要的自然寄主是刺李（犘 狉 狌 狀 狌 狊狊 狆 犻 狀 狅 狊 犪），其他如杏（犘 狉 狌 狀 狌 狊 犪 狉 犿 犲 狀 犻 犪 犮 犪）、桃（犘狆 犲 狉 狊 犻 犮 犪
11、）和日本的李子（犘犱 狅 犿 犲 狊 狋 犻 犮 犪）以及甜樱桃（犘犪 狏 犻 狌 犿）和酸樱桃（犘犮 犲 狉 犪 狊 狌 狊）。菊叶香藜（犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犳 狅 犲 狋 犻 犱 狌 犿）和克利夫兰烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 犮 犾 犲 狏 犲 狉 犾 犪 狀 犱 犻 犻）通常作为草本指示植物。犃 寄主症状犃 刺李（犘 狉 狌 狀 狌 狊 狊 狆 犻 狀 狅 狊 犪）和日本的李子（犘犱 狅 犿 犲 狊 狋 犻 犮 犪）：叶片上出现严重的扩散淡绿环或斑驳，果皮上出现深色的环，果肉出现红色或淡红色，果核带棕色斑点，大约有 果实在未成熟前落果。犃 桃（犘 狉 狌
12、 狀 狌 狊 狆 犲 狉 狊 犻 犮 犪）、甜樱桃（犘犪 狏 犻 狌 犿）和酸樱桃（犘犮 犲 狉 犪 狊 狌 狊）：叶片出现黄化叶脉、褪绿斑点和畸形，果皮出现散布的淡黄色斑点。犃 杏（犘 狉 狌 狀 狌 狊 犪 狉 犿 犲 狀 犻 犪 犮 犪）：叶片出现散布的暗绿色斑和线，果实变形，果皮散布着坏死环，核上有黄色的环。犃 菊叶香藜（犆 犺 犲 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狌 犿犳 狅 犲 狋 犻 犱 狌 犿）：当摩擦接种时，叶片上表现为枯斑症状。犃 克利夫兰烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 犮 犾 犲 狏 犲 狉 犾 犪 狀 犱 犻 犻）：经过摩擦接种时，全株表现为系统性侵染症状。犃 传播途径
13、自然条件下由蓟短尾蚜（犅 狉 犪 犮 犺 狔 犮 犪 狌 犱 狌 狊），桃短尾蚜（犅犺 犲 犾 犻 犮 犺 狉 狔 狊 犻），忽布疣额蚜（犘 犺 狅 狉 狅 犱 狅 狀犺 狌 犿 狌 犾 犻）和桃蚜（犕 狔 狕 狌 狊 狆 犲 狉 狊 犻 犮 犪 犲）作非持久性传播，并易经汁液接种传播；长距离扩散则主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运。犃 血清学特性 是良好的免疫原。根据血清学可将 划分为 （）、（）、（）、四种血清型，其中株系和株系为最主要流行株系。犃 基因组特征 基因为单分体基因组，含有一条正单链 分子，大小约 核苷酸，其外面包被 个均一的蛋白质亚基。的 端为 ，端为 （）。基因组编码一个长的多聚蛋白，随后自身催化裂 解产 生 个产 物：包 括（端 蛋 白，），（蛋 白 酶 辅 助 成 分，），（），（细胞质内含体蛋白，），（与基因组连接的蛋白，），（核内含体蛋白，包括 ），（核内含体蛋白，依赖于 的 聚合酶）以及（外壳蛋白：）。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售