1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?泰勒氏焦虫检疫规范?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前?言?本标准按照?给出的规则起草?本标准是依照?出入境动物检验检疫技术标准编写的基本规定?的要求?参考了?陆生动物手册?英文版?章?泰勒氏焦虫病?以及国内外的有关泰勒氏焦虫检疫研究的最新进展进行制定?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位?中华人民共和国重庆出入境检验检疫局?西南大学?本标准主要起草人?李应国?聂福平?肖进文?王国民?王昱?聂奎?刘生峰?吴丰春?周启明?泰勒氏焦虫检疫规范?范围本标准规定了泰勒氏焦虫的病原鉴定?间接免疫荧光试验?酶联
2、免疫吸附试验?聚合酶链式反应检疫技术要求?本标准适用于牛?羊等反刍动物及其血液制品中的泰勒氏焦虫的检疫?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件?仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?分析实验室用水规格和试验方法?梨形虫病病原鉴定方法?术语和定义下列术语和定义适用于本文件?泰勒氏焦虫?梨形虫纲泰勒科的一种由硬蜱传播的主要感染牛羊和其他野生动物的专性细胞内寄生原虫?主要包括环状泰勒氏焦虫?小泰勒氏焦虫?及瑟氏泰勒氏焦虫?等?裂殖体?寄生于巨噬细胞和淋巴细胞内进行裂体增殖所形成的多核虫体?也称石榴体或柯赫氏蓝
3、体?配子体?泰勒氏焦虫寄生于外周血红细胞内的特定中间形体?分为逗点形的小配子体和卵圆形的大配子体?临床诊断?发病症状牛?羊等动物体表有蜱寄生或蜱叮咬的痕迹?体温升高?呈稽留热?呼吸急促?体态消瘦?病理变化牛?羊等动物的可视粘膜黄染?有出血斑点?体表淋巴结显著肿胀?流行病学本病以硬蜱为传播媒介?通过叮咬传播?具有明显的地域性和季节性?实验室诊断?病原鉴定按?规定的方法进行实验和结果判定?间接免疫荧光试验?设备?材料和试剂?设备低温超速离心机?荧光显微镜?普通光学显微镜?冰箱?动物解剖用器械?动物解剖台?微型混合器?振荡器及水平摇床?试剂和材料丙酮?分析纯?甲醇?分析纯?肝素钠或?标准阳性血清和阴
4、性血清?由指定单位提供?异硫氰酸荧光?标记的抗牛?羊?免疫球蛋白抗体?伊文思蓝染液?溶液?固定液?含?丙酮和?甲醛的?的叠氮钠?台盼蓝染色液?甘油?试剂配制见附录?铝箔?干冰或液氮?穿刺针?微量移液器?注射器和针头?多孔聚乙烯载片?或普通玻璃载片?样品采集?活体动物?血液无菌采集牛?羊?静脉血液?加入到已加有?溶液的抗凝血剂离心管中?并不断摇动离心管?混匀?离心?吸取含有少量红细胞?白细胞的上层血浆?补加少量生理盐水?离心?取沉淀备用?血清无菌采集牛?羊?静脉血液?当日分离血清?将新鲜采集的血液首先在室温自然凝固?置?温箱?冰箱过夜?待血块全部收缩后分离血清?组织标本无菌穿刺?采集待检动物肩前
5、淋巴结或腹股沟淋巴结组织?用于组织涂片?动物尸体死亡动物应在其死亡后?内完成采样工作?采集样品应包括来自蹄冠?耳尖及尾尖的外周血以及大脑皮层?肾?肝?脾和骨髓等脏器?运输和保存采集的血液样品?若?内不能运送到实验室?需冷藏方法运送血清?血清于?保存?采集动物尸体的样品?需?低温保存并迅速运输到实验室?操作步骤?裂殖体抗原的制备?裂殖体抗原涂片?培养?的小泰勒氏焦虫或环形泰勒氏焦虫裂殖体感染的淋巴细胞?细胞密度约为?个?且感染率至少在?以上?收集细胞?离心?将收集的细胞?用?预冷的?悬浮?离心?洗涤?次?用?重悬?并使细胞密度在?个?吸取制备好的细胞悬液?滴加到多孔聚乙烯载片?或普通玻璃载片?上
6、?制作细胞涂片?使每个视野下的细胞数在?个?个之间?倍物镜观察?自然干燥?用丙酮固定?最后将片子用铝箔包起来?放入密闭容器中?或?保存备用?裂殖体抗原悬液?取?泰勒氏焦虫感染牛?羊?淋巴细胞?密度在?个?离心?细胞沉淀用?预冷的?洗涤?次?细胞经?台盼蓝染色确定 其 活 力?其 活 力 应 不 小 于?洗 涤 后 的 细 胞 重 悬 于 预 冷 的?溶 液 中?使 细 胞 密 度 为?个?滴加?倍体积的预冷固定液固定细胞悬液并轻轻搅拌?置?固定?固定后的细胞用预冷?洗?次?离心?收集细胞?用预冷的?重悬细胞?使细胞密度为?个?将细胞悬液分装?每份?细胞悬液中添加?的叠氮钠?可在?保存?周?永久
7、保存?备用?配子体抗原的制备?配子体抗原涂片?颈静脉采集配子体浓度不小于?的静脉血?用肝素钠或?抗凝?缓慢加入?轻柔混合?离心?去除血浆及血沉棕黄层?将红细胞再次重悬于?中?洗涤红细胞?次?确保完全去除血浆及血沉棕黄层?取少量洗涤后的红细胞用?倍比系列稀释?滴?各稀释度的红细胞于玻璃载片上?自然干燥后用甲醇固定?姬母萨染色?镜检形成均匀单层细胞的稀释度为大规模制备配子体抗原涂片的稀释度?制备配子体抗原涂片自然干燥后?用?丙酮固定?配子体抗原涂片保存条件同裂殖体抗原涂片?配子体抗原悬液?颈静脉采集配子体浓度不小于?的静脉抗凝血?肝素钠或?抗凝?缓慢加入?轻柔混合?离心?去除血浆及血沉棕黄层?将红
8、细胞再次重悬于?中?洗涤红细胞?次?确保完全去除血浆及血沉棕黄层?洗涤完毕后的红细胞用?倍体积的?重悬?且血细胞压集浓度为?用?倍体积固定液固定?同裂殖体抗原悬液固定液?固定?洗涤?次?离心?用?重悬红细胞?添加?的叠氮钠?分装成每管?可在?可保存?年?备用?抗原的标准化?制备的裂殖体抗原悬液或配子体抗原悬液振荡混匀后?用?倍比系列稀释至?用光学显微镜?倍物镜?检查每个稀释度的细胞密度?将单个视野下有?个?个裂殖体感染红细胞的稀释度作为工作浓度?将工作浓度的抗原悬液作成涂片?与系列稀释的标准阳性血清和阴性血清作用均无荧光信号?则制备的抗原可作为常规?检测用抗原?制备的裂殖体抗原涂片或配子体抗原
9、涂片按此方法进行标准化?淋巴细胞裂解物制备?个月大的小牛经脾切除并饲养于无蜱及蝇的环境中?以避免潜伏感染泰勒氏焦虫?每天血液涂片检测虫体一次?持续检测?周?若未检出虫体即可屠宰?取其胸腺及淋巴结?切为小块?放于预冷的含?的?中?振摇容器?使淋巴细胞从组织块释放入缓冲液中?用细薄?棉布过滤?除去 组 织 碎 片?收 集 淋 巴 细 胞?将 收 集 的 细 胞 用 含?的?洗 涤?次?离 心?洗 涤 后 的 细 胞 重 悬 于?无?中?确 保 细 胞 浓 度 约 为?个?细胞在冰上经超声波破碎?细胞裂解产物?离心?收集上清液?去除沉淀?并调整上清的蛋白浓度到?将细胞裂解液?上清液?分装为每等份?保
10、存于?备用?储存及运输丙酮固定的抗原涂片保存于?或?要存储在干冰或液氮中运输?抗原悬液则保存于?或?可在常温中运输?检测步骤?将制备好的抗原涂片从低温冰箱取出?在?冰箱解冻?再室温中放置?将制备好的抗原悬液?保存的裂殖体抗原悬液需先于室温解冻?振荡重悬并用带?号针头的注射器抽吸分散红细胞团块?按照?方法进行抗原的标准化?然后制作抗原涂片?待用?如用?中制备的涂片?滴加?用淋巴细胞裂解液?稀释的待检血清?置湿盒中室温静置?同时设立阳性血清及阴性血清对照?均为?稀释?如用?中的抗原涂片则待检血清需设?及?两个稀释度?用?洗涤?次?每次?洗涤后每个抗原区加入?异硫氰酸荧光?标记的抗牛?羊?免疫球蛋白
11、抗体?并添加最终稀释度为?的伊文思蓝染色?置湿盒中?室温孵育?用?洗涤?次?每次?用盖玻片覆盖?从一侧滴加含?甘油?进行封片?待其均匀分散后?在荧光显微镜下观察?结果判定阳性对照细胞胞浆呈亮绿色或者黄绿色?阴性对照无可见荧光?阴?阳性对照成立?方可进行结果判定?待检细胞胞浆呈现明显的亮绿色或者黄绿色?判为阳性?待检细胞胞浆无亮绿色或者黄绿色颗粒?判为阴性?待检细胞胞浆呈现微弱的亮绿色或者黄绿色?判为阴性可疑?可疑者需要进一步重复实验?若再次实验结果?胞胞浆无亮绿色或者黄绿色颗粒?判为阴性?细胞胞浆呈现微弱的亮绿色或者黄绿色?判为阳性?间接酶联免疫吸附试验?设备?材料和试剂?设备离心机?高压灭菌
12、器?水浴锅?冰箱?洗板机?酶标仪?材料和试剂标准阳性血清?标准阴性血清?标记抗牛?抗体?标记的抗牛?二抗?底物?终止液?溶液?配制见附录?微量移液器?试剂盒是瑞典?公司提供的产品的商品名?是适合的市售产品的实例?给出这一信息是方便本标准的使用者?并不表示对这一产品的认可?目前该公司只提供检测突变泰勒氏焦虫和小泰勒氏焦虫的?试剂盒?采用?试剂盒?进行泰勒氏焦虫抗体检测?如果其他等效产品具有相同的效果?则可使用?这些等效产品?样品采集?保存无菌采集静脉血液?分离血清?冰箱内保存?操作步骤?所有的试剂在正式使用前需提前放置到室温下平衡?根据检测样品的数量?取出一定数量的包被好抗原的酶标板条?做好标识
13、?用?溶液将试剂盒提供的?标记抗牛?抗体?冻干粉?充分溶解?并混匀?将待检血清?阳性对照血清及阴性对照血清用?溶液作?稀释?吸取?的阳性血清?阴性血清?加入相应的位置?每种对照均同时做双份重复?吸取?稀释好的待检血清样品?加入相应的位置?每个样品均同时做双份重复?密封酶标板?置?孵育?每孔加入?的?洗涤缓冲液?平放于低速摇床上水平连续摇动?用力拍去孔中的洗涤液?重复洗涤?次?每孔加入?标记的抗牛?二抗?密封酶标板?置?孵育?同步骤?每孔加入?底物?室温静置?从加第一孔开始计时?每孔加入?终止液?混匀?用酶标仪测定?的吸收值?需在添加终止液后?内完成?数据计算计算每个对照及样品的平均?值?阴性对
14、照及待检样品的?值计算见式?式中?样品或阴性对照的平均?值?阳性对照的平均?值?结果判定结果判定如下?判定前提?阴?阳性对照成立?即阳性重复之间的?值差异应该小于等于?且阳性样品?值在?之间?阴性对照的?值小于?抗体阳性?抗体阴性?聚合酶链式反应?设备离心机?高压灭菌器?水浴锅?冰箱?扩增仪?水平电泳仪及电泳槽?凝胶成像系统?材料和试剂水?用?中的三级水?乙醇?琼脂糖粉?蛋白激酶?为阴性对照?为阳性对照?溶液?缓冲液?缓冲液?配制见附录?核酸提取及聚合酶链反应?采用?试剂盒?进行泰勒氏焦虫检测?如果其他等效产品具有相同的效果?则可使用这些等效产品?试剂盒是德国?公司提供的产品的商品名?是适合的
15、市售产品的实例?给出这一信息是方便本标准的使用者?并不表示对这一产品的认可?样品采集?保存无菌采集?每?含?抗凝剂?的抗凝血液?保存备用?操作步骤?血细胞样本制备将无菌采集的静脉血液加入到已加有?溶液的抗凝血剂离心管中?混匀?血液中虫体?提取?按照?体积比?向红细胞悬液中加入红细胞裂解液?然后加入两倍红细胞体积预冷的灭菌去离子水?轻轻上下颠倒?次?次?将三种液体混匀?然后在冰上静置?离心?将上清液弃去?同时往该管加入?缓冲液?及?高压灭菌的去离子水?将红细胞沉淀悬浮?然后?离心?如果沉淀还呈红色?可以重复该步?洗至无色?往有沉淀的离心管中加入?缓冲液?及?涡旋振荡?混匀?然后加入新鲜配制预冷?
16、冰水混合物?的?蛋白激酶?溶液?将离心管放置?水浴?然后取出放置到冰上?冷却到室温即可?加入?的氯化钠溶液?轻轻振荡混匀?离心?小心移去上清液?切忌触动沉淀?加入等体积的冰异丙醇?冰水混合物上预冷?上下颠倒?次?次混匀?在?静置?以充分沉淀核酸?离心?小心移去上清液?加入?冰乙醇?预冷?离心?洗涤?沉淀?重复?次?移去冰乙醇后?将离心管开口放置于?温箱进行干燥?最后加入?高压灭菌水?室温中过夜溶解?低温?保存获得的?或立即进行聚合酶链反应?聚合酶链式反应提前将试剂?在?或室温?解冻?反应体系组成?试剂?试剂?样本模板?或阴?阳性对照?循环参数?个循环?电泳用?的?凝胶电泳缓冲液进行凝胶电泳?检测?扩增产物?结果判定阳性对照?只有一条?的条带?阴性对照?无任何可见条带?阴?阳性对照成立时?若样品扩增出与阳性对照一样的?目的条带则判定该样品为阳性?否则为阴性?附?录?规范性附录?溶液的配制?溶液?氯化钠?氯化钾?磷酸氢二钠?磷酸二氢钾?加去离子水定溶到?用氢氧化钠调?高压灭菌?室温保存?固定液?指含?丙酮和?甲醛的?溶液?丙酮原液?甲醛?加入?溶液?定溶至?即得?叠氮钠溶液叠氮钠?加入双蒸