1、实验研究利多卡因对糖尿病大鼠脊髓神经元的损伤作用樊晨璐陈陵张学康陈世彪郑小兰DOI:1012089/jca202303013基金项目:江西省自然科学基金资助项目(20192BAB205041);江西省教育厅科学技术研究项目(180135)作者单位:330006南昌大学第一附属医院麻醉科(樊晨璐、张学康、陈世彪、郑小兰)，应急处(陈陵)通信作者:郑小兰，Email:615833628 qqcom【摘要】目的探讨利多卡因对糖尿病大鼠脊髓神经元的损伤作用。方法选择健康 SPF 级雄性 SD 大鼠 30 只、GK 大鼠 30 只，12 周龄，体重 180200 g。取大鼠脊髓神经元进行体外分离培养。采
2、用随机数字表法将大鼠脊髓神经元分为四组:SD 大鼠脊髓神经元组(C 组)、SD 大鼠脊髓神经元+利多卡因组(CL 组)、GK 大鼠脊髓神经元组(GK 组)和 GK 大鼠脊髓神经元+利多卡因组(GKL 组)。C 组和 GK 组置于 DMEM 高糖培养基中，在 37，5%CO2培养箱内培养 24 h，CL 组和GKL 组在相同条件下加入浓度为 2 mmol/L 的利多卡因培养 24 h。采用 Western blot 法检测脊髓神经元中自噬相关蛋白 PINK1、mTOC1、AMPK、p-AMPK、LC3和 LC3含量，DCFH-DA 法检测脊髓神经元中活性氧(OS)含量，免疫荧光法检测脊髓神经元中
3、 PINK1 和 LC3 含量。结果与 C 组比较，CL 组、GK 组和 GKL 组脊髓神经元 PINK1、LC3 含量和 p-AMPK/AMPK、LC3/比值均明显升高(P0.05)，mTOC1 含量明显降低(P0.05)，OS 含量明显升高(P0.05)。与 GK 组比较，GKL组脊髓神经元 PINK1、LC3 含量和 p-AMPK/AMPK、LC3/比值明显升高(P0.05)，mTOC1 含量明显降低(P0.05)，OS 含量明显升高(P0.05)。结论利多卡因诱导 GK 大鼠脊髓神经元的自噬相关蛋白的表达及 OS 的释放，加重对 GK 大鼠脊髓神经元的损伤。【关键词】利多卡因;糖尿病;
4、脊髓神经元;损伤Injury effect of lidocaine on spinal cord neurons of diabetic ratsFAN Chenlu，CHEN Ling，ZHANGXuekang，CHEN Shibiao，ZHENG Xiaolan Department of Anesthesiology，First Affiliated Hospital ofNanchang University，Nanchang 330006，ChinaCorresponding author:ZHENG Xiaolan，Email:615833628 qqcom【Abstract】O
5、bjectiveTo explore the injury effect of lidocaine in spinal cord neurons of diabeticrats MethodsThirty SPF healthy SD rats and thirty GK rats，aged 12 weeks，weighing 180200 g wereselected The spinal cord neurons of rats were isolated and cultured in vitro，and randomly divided into fourgroups:spinal c
6、ord neurons of SD rats group(group C)，spinal cord neurons of SD rats+lidocaine group(group CL)，spinal cord neurons of GK rats group(group GK)，and spinal cord neurons of GK rats+lido-caine group(group GKL)Spinal cord neurons in groups C and GK were placed in DMEM high glucose me-dium and cultured in
7、an incubator with 5%CO2at 37 for 24 hours Lidocaine at a concentration of 2mmol/L was added to groups CL and GKL，and then neurons in groups CL and GKL were cultured for 24hours under the same conditions as groups C and GK The content of autophagy-related proteins PINK1，mTOC1，AMPK，p-AMPK，LC3，and LC3
8、in spinal cord neurons was measured by Western blotThe content of reactive oxygen species(OS)in spinal cord neurons was detected by DCFH-DA The con-tent of PINK1 and LC3 in spinal cord neurons was measured by immunofluorescence esultsComparedwith group C，the content of PINK1，LC3，and p-AMPK/AMPK，LC3/
9、level in groups CL，GK andGKL were significantly increased(P 0.05)，the content of mTOC1 was significantly decreased(P 0.05)，and the content of OS was significantly increased(P 0.05)Compared with group GK，the con-tent of PINK1，LC3，and p-AMPK/AMPK，LC3/level in the group GKL were significantly increased
10、(P 0.05)，the content of mTOC1 was significantly decreased(P 0.05)，and the content of OS wassignificantly increased(P 0.05)ConclusionLidocaine aggravates the damage to spinal cord neuronsof GK rats by promoting the expression of autophagy-related proteins and the release of OS【Key words】Lidocaine;Dia
11、betes mellitus;Spinal cord neurons;Injury982临床麻醉学杂志 2023 年 3 月第 39 卷第 3 期J Clin Anesthesiol，March 2023，Vol39，No3近几十年来，糖尿病(diabetes mellitus，DM)等代谢性疾病的全球患病率飞速上升，糖尿病已成为全球主要及致死率高的疾病之一1。糖尿病神经病变(diabetic neuropathy，DN)可导致疼痛、运动能力减退，甚至截肢，是糖尿病最严重的并发症之一2。糖尿病患者逐年增多，需要接受手术治疗的糖尿病神经病变患者也逐年增多。局麻药是临床实施神经阻滞麻醉与术后镇痛的
12、药物。利多卡因作为一种起效快、神经阻滞效果好的局麻药常用于临床麻醉中。Koo 等3 研究表明，临床使用的局麻药都有潜在的神经毒性，利多卡因的神经毒性大于其他常用局麻药。糖尿病神经病变使得病变神经对局麻药的敏感性增加4。利多卡因可能通过p38 MAPK信号通路促进糖尿病神经病理性痛大鼠的脊髓神经元的凋亡56。本实验研究在细胞水平探讨利多卡因对糖尿病大鼠脊髓神经元的损伤作用，为研究利多卡因导致糖尿病神经毒性的机制研究提供新的思路。材料与方法实验动物选择健康雄性 SPF 级 SD 大鼠 30只、GK 大鼠 30 只，12 周龄，体重 180200 g，购于南昌大学实验动物科学部 XYXK(赣)202
13、10003。维持室温 20 25、湿度 60%、12 h/12 h 光暗循环，单笼饲养。实验期间自由饮水、摄食，喂食普通饲料，隔天更换垫料 1 次，适应性喂养 1 周。本实验经南昌大学第一附属医院动物伦理委员会审查批准实施(CDYFY-IACUC-202206Q002)。实验分组与处理SD 大鼠和 GK 大鼠脊髓神经元体外分离培养后，采用随机数字表法将两种大鼠脊髓神经元分为四组:SD 大鼠脊髓神经元组(C组)、SD 大鼠脊髓神经元+利多卡因组(CL 组)、GK大鼠脊髓神经元组(GK 组)和 GK 大鼠脊髓神经元+利多卡因组(GKL 组)。C 组和 GK 组置于 DMEM高糖培养基中，在 37，
14、5%CO2培养箱内培养 24h，CL 组和 GKL 组在相同条件下加入浓度为 2mmol/L 的利多卡因培养 24 h。大鼠脊髓神经元的分离与培养腹腔注射 1%戊巴比妥钠 50 mg/kg 麻醉大鼠，颈椎脱臼法处死。剖开胸腹，暴露脊柱，分离脊髓，剥离脊髓上的血管膜和脊膜，将脊髓组织移入离心管内，用剪刀剪成0.51 mm3，加入混合胶原酶置于 37 细胞培养箱中消化 20 min;再用等体积的含有 10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基终止消化，使用低速离心机1 500r/min 离心 5 min;丢弃上清，加入高糖培养基重新悬置脊髓细胞后移入培养皿中，再置于 37、5%CO2培养箱内培养。Wes
15、tern blot 法脊髓组织匀浆、离心后提取蛋白。使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取25 g 蛋白，在 10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳、转膜，用 5%脱脂奶粉在 37 下封闭 2 h。加入PINK1(1 1 000)、mTOC1(1 1 000)、AMPK(1 1 000)、p-AMPK(1 1 000)、LC3(1 1 000)、LC3(1 1 000)一抗，4 孵育过夜;加入辣根过氧化物酶标二抗(1 5 000)稀释液 37 孵育 1 h。孵育结束后加入 ECL 发光液，利用一体式化学发光仪摄片。采用 ImageJ 软件对蛋白条带进行灰度分析。OS 检测按照 1 1 0
16、00 用无血清培养液稀释 DCFH-DA，终浓度为 10 mol/L。将脊髓神经元细胞收集后悬浮于 DCFH-DA 中，细胞浓度为 1106/ml，37 细胞培养箱内孵育 10 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞 3 次。加入用无血清培养液稀释的 Hoechst33342 后，在 37 细胞培养箱内孵育10 min。再用无血清细胞培养液洗涤细胞 3 次，将脊髓神经元细胞加入完全培养基中。用倒置荧光拍照显微镜拍照观察。采用 ImageJ 软件进行荧光强度分析。免疫荧光法取出培养好的细胞爬片，PBS 液漂洗 1 次，4%多聚甲醛固定 15 min，PBS 液漂洗 3次5 min。0.1%Triton 室温下处理 10 min，PBS 液漂洗 3 次5 min，用 5%胎牛血清 37 孵育 1 h。加入 PINK1(1 1 000)、LC3(1 1 000)一抗，4 孵育过夜;PBS 液洗 3 次5 min，加入二抗，于 37 避光孵育 1 h，PBS 液漂洗 3 次5 min。加入 Hoechst33258 室温避光孵育 15 min，PBS 液漂洗 3 次5min。封片，在激光共聚焦显微