1、食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES942023 Vol.49 No.5(Total 473)DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 031918引用格式:胡晓龙，冯大鸿，张勇，等 浓香型酒醅中梭菌群落演替及其与理化性质的相关性分析J 食品与发酵工业，2023，49(5):94 100 HU Xiaolong，FENG Dahong，ZHANG Yong，et al Dynamic clostridial community succession and its corre-lation with physicochemical fa
2、ctors in Jiupei for strong flavor Baijiu productionJ Food and Fermentation Industries，2023，49(5):94 100浓香型酒醅中梭菌群落演替及其与理化性质的相关性分析胡晓龙1，冯大鸿1，张勇1，迟雷1，郑燕1，韩素娜2，沈祥坤3，魏涛1*1(郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州，450001)2(河南仰韶酒业有限公司博士后科研工作站，河南 三门峡，47240)3(河南省食品工业科学研究所有限公司，河南 郑州，450053)摘要采用高通量测序和实时荧光定量 PC 技术解析了浓香型酒醅发酵过程中梭菌
3、纲细菌群落多样性、组成及演替规律，并对酒醅梭菌群落及其理化因子进行了冗余分析(redundancy analysis，DA)和 Pearson 相关性分析。结果表明，梭菌的多样性和相对丰度在发酵第 7 天最低，45 d 达到最高。供试样品中梭菌群落由 1 个目、13 个科和 39 个属组成，其中 Caproiciproducens(己酸菌属)和 Clostridium_sensu_stricto_1(狭义梭菌属 1)是主要的菌属，均呈现先减少后增加再减少的趋势。DA 结果表明，理化因子的贡献率依次为温度(45 5%)含水量(17 8%)铵态氮(11 0%)还原糖(10 3%)乙醇(8 0%)p
4、H(5 2%)总酯(1 5%)总酸(0 6%)，温度与梭菌群落结构呈极显著关系(P 0 01)。Caproiciproducens、Fonticella、Anaerofilu 与总酸呈显著正相关(0.01 P 0 05)，与含水量呈极显著正相关(0 001 P 0 01)。此外，含水量与 Butyrivibrio_2(丁酸弧菌属)具有更强的相关性(0 000 1 P 0 001)，温度与相对丰度前 10 种梭菌均呈负相关。该研究丰富了浓香型白酒发酵过程中对梭菌群落及其影响因素的认识，为发酵过程中梭菌群落的调控提供了理论支撑。关键词浓香型白酒;酒醅;梭菌;理化性质;相关性第一作者:博士，副教授(
5、魏涛教授为通信作者，E-mail:weit8008 zzuli edu cn)基金项目:国家自然科学基金项目(31801535);河南省重点研发与推广专项项目(222102110214);中原产业创新领军人才项目(214100510009);中原科技创新领军人才项目(224200510017);三门峡市引进高层次创新创业人才(团队)产业化项目(2020111)收稿日期:2022-04-11，改回日期:2022-05-17中国白酒根据酿造工艺、原料和风味特征等差异可将其分为浓香型、酱香型、清香型和米香型等多种香型1。其中浓香型白酒因其具有窖香浓郁、绵柔醇厚、香味协调、回味悠长的风格特点而深受广大
6、消费者的青睐2。酒醅是浓香型白酒酿造微生物的主要载体，微生物群落多样性及组成是影响浓香型白酒独特风味和品质的主要因素之一3。近年来，高通量测序技术的广泛应用极大地丰富了人们对白酒酿造微生物的认识。胡晓龙等3 发现酒醅中微生物主要为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)等，其中厚壁菌门在酒醅和窖泥微生物中占绝对优势，其相对丰度能达到 50%以上。梭菌纲细菌(梭菌)是浓香型白酒酿造过程中一类重要的功能菌，隶属于厚壁菌门，具有多种代谢活动，包括将淀粉转化为己酸(己酸乙酯的前体物质)、丁酸、醇等4。早在 20 世纪 60年代梭
7、菌就被认为是浓香型白酒重要风味物质己酸乙酯的重要贡献菌5。近年来已经从不同酒企的窖泥中分别分离得到克鲁氏梭菌(Clostridium kluyve-ri)6、耳蜗形梭菌(C luticellarii)7 和丁酸梭菌(Cbutyrieum)8 等，并证明和产己酸、丁酸密切相关。尽管梭菌是酒醅中的优势微生物之一，但是目前关于梭菌的研究主要集中在窖泥样品及梭菌的代谢物分析中9 11，而对酒醅样品中梭菌群落多样性及其演替规律研究鲜有报道。因此，本研究采用高通量测序技术结合实时荧光定量方法对酒醅梭菌群落的多样性、组成及其含量动态变化进行解析。同时，通过结合酒醅理化性质的变化，探索了梭菌群落和酒醅理化性质
8、的关联性，有助于进一步揭示梭菌群落在整个酿造周期内的演替规律及其影响因素。1材料与方法1 1材料与试剂样品采集:随机选取正常发酵的 3 口平行窖池，对每口窖池中发酵第 3、7、15、25、45、60 天的酒醅进研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)95行跟踪取样。对每口窖池下层(距窖底约 50 cm)平面上任一对角线的 1/2、1/4 及其距窖壁 20 cm 处 3个不同位置的酒醅分别采集并混匀作为该窖池的代表性酒醅样品。因此，本研究共选取了 18 个样品，采集完成后装入已标记编号的无菌袋中并保存于30 备用，其编号分别为 B3-1、B3-2、B3-3、B7-1、B7-2、B
9、7-3、B15-1、B15-2、B15-3、B25-1、B25-2、B25-3、B45-1、B45-2、B45-3、B60-1、B60-2、B60-3。以编号B3-1、B3-2、B3-3 为例，其中 B 代表下层酒醅，第一个数字 3 代表发酵时间为 3 d，-1、-2 和-3 代表3 个平行样品。主要试剂:浓硫酸、酒石酸钾钠、苯酚、KCl、亚硝基铁氰化钠、NaClO、NH4Cl，天津市科密欧化学试剂有限公司;K2Cr2O7，天津市安吉瑞化工有限公司;酚酞、邻苯二甲酸氢钾、(NH4)2SO3，上海生工生物工程有限公司;DNS，上海麦克林生化科技有限公司。1 2仪器与设备MP200A 精密电子天平
10、，上海良丰仪器仪表有限公司;C1000 温度梯度 PC 仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司;TGL-20M 高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司;DYY-8C 电泳仪，北京市六一仪器厂;Mixer4K 微型涡旋混合仪，生工生物工程(上海)股份有限公司;PHS-3C 型 pH 计，雷磁上海仪电科学仪器股份有限公司;Multiskan FC 酶标仪，赛默飞世尔科技公司;电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。1 3实验方法1 3 1酒醅理化测定含水量测定:采用 105 干燥箱烘干恒重法测定。pH 检测:将酒醅按料液比 1 3(g mL)与超纯水混合均匀，然后用 pH 计检测。还原糖、乙醇、
11、铵态氮、总酸、总酯均参照文献 12的方法进行测定。1 3 2酒醅样品 DNA 提取按照 PowersoilDNA Isolation Kit 试剂盒说明书提取酒醅 DNA，然后利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测提取 DNA 质量。1 3 3酒醅 DNA 检测使用引物 338F:5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3，806:5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 扩增合格总 DNA 样品，并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用 Illumina HiSeq 2500 进行测序。1 3 4生物信息分析首先使用 Trimmomatic
12、v0 33 软件对测序得到的aw eads 进行过滤，然后使用 cutadapt 1 9 1 软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量 eads;使用 FLASH v1 2 7 软件，通过 overlap对每个样品高质量的 eads 进行拼接，得到的拼接序列即 Clean eads;使用 UCHIME v4 2 软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据(effective reads)。其中相似性97%的序列归为 1 个操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，将 OTU 代表序列与 Silva 数据库进行比对和物种注释。挑选梭菌纲细菌结
13、果用于后续分析。1 3 5实时荧光定量 PC以细菌通用引物 对 27F/1492 扩增菌株 Clos-tridium butyricum D9(本实验室保存)的 16S rNA 序列全长，将该 PC 扩增产物连接 pMD19-T 载体，转化大肠杆菌 JM109，培养后挑选出阳性克隆子。提取阳性克隆子质粒测定其吸光值并换算为质粒拷贝数(copies)，10 倍梯度稀释为 DNA 模板。采用细菌通用引物对 515F/806 和梭菌引物对 SJ-F/SJ-分别对上 述 模 板 进 行 实 时 荧 光 定 量 PC 扩 增，以lg(copies/L)为横坐标，对应的 Ct 值为纵坐标，分别绘制细菌和梭
14、菌的荧光定量标准曲线，其中细菌和梭菌荧光定量 PC 扩增体系及条件分别参照文献 13和 14 的方法。以每个酒醅样品的 DNA 为模板利用上述引物和方法并测定其 Ct 值，分别根据细菌和梭菌荧光定量标准曲线计算每个样品中的细菌及梭菌的含量。1 3 6数据处理使用 SPSS 26 进行理化因子显著性分析，选择Duncan s 多重比较方法，不同小写字母表示处理之间存在显著差异(P 0 05)。Shannon 指数的计算如公式(1)所示。H=si=1(Pi ln Pi)(1)式中:H，Shannon 多样性指数;s，微生物属的总数;Pi，第 i 个属的数量占总数的比例。柱状图、标准曲线均使用 Or
15、igin 9 0 绘制。采用HemI 软件绘制热图，Canoco 5 软件绘制主成分分析(principal component analysis，PCA)图和冗余分析(redundancy analysis，DA)图。Shannon 指数箱线图和相关性热图使用 TUtool 云平台完成。食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES962023 Vol.49 No.5(Total 473)2结果与分析2 1理化性质分析如表 1 所示，根据发酵过程中酒醅的温度变化可以将整个发酵周期分为 3 个阶段，即升温期(3 7 d)、稳定期(7 25 d)和降温期(25 60
16、d)，这与HU 等15 的研究结果一致。这主要是由于发酵前期酒醅营养充足，有利于微生物的生长繁殖，从而产生大量发酵热16。随着发酵时间的延长，酒醅中的营养成分逐渐减少，微生物生长和代谢减缓，酒醅温度在 34 保持 18 d 左右。在发酵后期，酒醅中可利用养分基本耗尽，加上乙醇和酸的增加，部分不适应环境的微生物逐渐死亡或者休眠17，发酵作用和微生物活动均减小，酒醅温度下降。在发酵前7 d，酒醅中除含水量下降外，其余理化指标均上升;在发酵 7 25 d，乙醇、总酸含量和含水量上升，还原糖和总酯含量开始下降铵态氮略微上升后下降;在发酵 25 60 d，含水量和总酸均在 45 d 时达到最大值，分别为(63.76 3.43)%和(24.63 2)mg/g，然后下降，铵态氮和总酯在 45 d 时略微上升而后下降;还原糖和 pH 则在 45 d 时下降至最低值(6.08 5.82)mg/g 和 3.36;乙醇在 45 d 时略微下降，然后在60 d 时升至最高值(126.42 10.37)mg/g。酒醅 pH 在发酵前 45 d 均呈现下降趋势，发酵结束时略有回升。在发酵过程中，水分是保障酒醅中微