1、棘胸蛙致病性荧光假单胞菌的分离鉴定徐悦玉1，林德2，赵淑芳1*（1.丽水学院 医学院，浙江 丽水 323000；2.丽水学院附属第一医院 检验科，浙江 丽水 323000）摘要：为进一步研究棘胸蛙烂皮病的致病菌，从丽水龙泉某养殖场挑选出患有烂皮病的棘胸蛙,并从病蛙患处分离出一株新致病菌。通过形态观察、革兰氏染色、质谱分析、16SrRNAPCR 产物测序、人工感染试验和系统进化树分析，鉴定该菌株为荧光假单胞菌。纸片扩散法药敏实验结果表明：该菌株对链霉素、庆大霉素、阿米卡星、多黏菌素和氧氟沙星高度敏感，对氯霉素和复方新诺明中度敏感，对红霉素、头孢唑林、青霉素和氨苄西林产生耐药。关键词：棘胸蛙；荧光
2、假单胞菌；药物敏感性doi：10.3969/j.issn.2095-3801.2023.02.003中图分类号：S947.2文献标志码：A文章编号：2095-3801（2023）02-0017-06Isolation and Identification of Pathogenic Pseudomonas Fluorescens fromQuasipaa SpinosaXUYueyu1,LINDe2,ZHAOShufang1*（1.School ofMedicine,Lishui University,Lishui 323000，Zhejiang；2.Clinica Laboratory，Th
3、e First Affiliated Hospital ofLishui University，Lishui 323000，Zhijiang）Abstract：In order to further study the pathogenic bacteria of rotten skin disease,Quasipaa spinosas with rottenskin disease were selected from a farm in Longquan,Lishui,and a new pathogenic bacteria was isolated from theaffected
4、part of the sick Quasipaa spinosa.Through morphological observation,Gram staining,mass spectrometryanalysis,sequencing of 16S rRNA PCR products,artificial infection test and phylogenetic tree analysis,the strainwas identified as Pseudomonas fluorescens.The results of drug sensitivity test by disk di
5、ffusion method showedthat the strain was highly sensitive to streptomycin,gentamicin,amikacin,polymyxin and ofloxacin,moderatelysensitive to chloramphenicol and compound sulfamethoxazole,and resistant to erythromycin,cefuroxime,penicillinand ampicillin.Key words：Quasipaa spinosa;Pseudomonas fluoresc
6、ens;drugsensitivity收稿日期：2022-08-21；修回日期：2022-11-24基金项目:浙江省公益技术应用研究项目“生态农业之石蛙烂皮病治疗新对策”（LGN20C190005）作者简介：徐悦玉，女，浙江松阳人。*通信作者：赵淑芳，女，湖南平江人，副教授，博士。丽 水 学 院 学 报JOURNAL OF LISHUI UNIVERSITY第 45 卷第 2 期Vol.45No.22023 年 3 月Mar.2023棘胸蛙（Quasipaa spinosa）又名石蛙、石鳞，含有丰富的矿物元素以及多种人体必需的氨基酸，具有较高的营养价值1，但其生长缓慢，生长环境要求高，且其自然
7、生长的环境逐渐被破坏2，野生数量急剧减少。随着市场上的需求不断增加，棘胸蛙价格不断升高，人工养殖应运而生。但因人工养殖技术尚未完善，疾病防治问题还未得到系统性的解决。因此，在人工养殖过程中，棘胸蛙较易发生各种疾病。目前国内已经有学者报道棘胸蛙的疾病主要有蓝眼病3、烂皮病4、白内障5、红腿病6、脱肛3、歪头病7、出血病8等。其中烂皮病是棘胸蛙人工养殖过程中最常见的一种疾病，该病具有一定的传染性，死亡率极高，给养殖户带来极大的损失。棘胸蛙烂皮病典型症状主要为皮肤溃烂缺损，其边缘整齐，与周围正常组织界线清晰，病蛙活动迟缓，食欲减退。棘胸蛙通常生活在昏暗的环境中，早期烂皮病不易被发现，一旦发病难以治愈
8、，故应以预防为主，改善环境，增强免疫力，抵抗致病菌2，因此找到相应的致病菌显得至关重要。导致棘胸蛙烂皮病的致病菌有很多种，目前研究发现的致病菌有蜡样芽孢杆菌9、蜂房哈夫尼菌10、奇异变形杆菌4、嗜水气单胞菌11、摩氏摩根菌12、布氏柠檬酸杆菌5、败血伊丽莎白菌13等。目前尚未报道荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）可致棘胸蛙烂皮病。本研究发现，荧光假单胞菌可通过损伤的皮肤导致棘胸蛙烂皮病，为棘胸蛙烂皮病的防治提供一定的理论依据。1材料与方法1.1材料健康棘胸蛙和患烂皮病的病蛙取自浙江省丽水市龙泉某石蛙专业人工养殖场。病蛙 4 只，大小不一。健康成蛙 30 只，规格 7
9、085 g/只，试验前将健康的棘胸蛙置于水族箱中喂养观察 3 d，确认无病后，将棘胸蛙随机分为 6 组，每组 5 只，置于 6个相同的且已用 75%的酒精消毒的水族箱。试验期间，每天上午喂食适量鲜活的黄粉虫，隔日换水，养殖所使用的水均经过曝气 2 d。水温（222），室温 26，营造安静、昏暗的仿生态环境10。培养基均购自杭州滨和微生物试剂有限公司，包括营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、沙氏琼脂培养基。药敏片均购自杭州驰业生物科技有限公司，包括红霉素药敏片、氯霉素药敏片、庆大霉素药敏片、青霉素药敏片、链霉素药敏片、头孢唑林药敏片、复方新诺明药敏片、阿米卡星药敏片、多黏菌素药敏片、氨苄西林药敏片、
10、左氧氟沙星药敏片。1.2试验方法1.2.1分离致病菌用 75%的酒精将病蛙体表消毒后，从棘胸蛙烂皮处取材，接种于普通营养琼脂培养基和沙氏培养基上，28 培养 24 h 后，观察菌落形态特征，选出优势单菌落进一步分离培养。1.2.2革兰氏染色将分离得到的单克隆菌株进行革兰氏染色10，在光学显微镜下观察并记录。1.2.3质谱鉴定质谱分析采用 IVD MALDI Biotyper 2.3 质谱分析系统，具体操作和分析方法参考文献中的质谱操作和分析方法10。1.2.416S rRNA 基因的 PCR 鉴定从平板上挑选一菌环的菌体，用煮沸法提取细菌 DNA。PCR 引物采用细菌 16S rRNA 基因通
11、用引物：正向 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,反向TACGGCTACCTTGTTACGACTT。反应条件为 945 min,94 45 s,53 45 s,72 1 min,72 5 min，35 个循环。引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR 产物送上海生工生物工程有限公司测序。1.2.5人工感染试验将纯化的细菌接种至营养肉汤液体培养基中，置于 28 摇床中，150 r/min，培养 16 h，再用细菌浊度仪测得菌液浓度，用生理盐水配制成 5108cfu/mL菌悬液4,10。充分消毒相应处理部位，分别采用皮下注射、肌肉注射和皮肤损伤浸泡 3 种方式感染棘胸蛙（表 1），每种途径
12、均设置对照组，感染试验期均为 15 d7。丽 水 学 院 学 报2023 年18表 1人工感染试验设置感染途径及组别菌液浓度/（cfu mL-1）剂量/mL棘胸蛙/只皮下注射51080.25肌肉注射51080.25损伤浸泡510850.05皮下注射（对照组）无菌生理盐水0.25肌肉注射（对照组）无菌生理盐水0.25损伤浸泡（对照组）无菌生理盐水50.05ABC图 1病蛙的外观徐悦玉，林 德，赵淑芳：棘胸蛙致病性荧光假单胞菌的分离鉴定第 2 期19每天观察试验组和对照组的棘胸蛙的外部特征，对比并拍照记录，若出现死蛙则立即进行解剖，观察其病变的组织和器官。1.2.6药敏试验药敏试验采用 Kirby
13、-Bauer 纸片扩散法。用接种环挑取单菌落于平板边缘相对 4 点，从每点开始密集划线涂布，直至细菌均匀密布于平板。每 6片药敏片等间距放置在一个平板上，纸片中央距离平板边缘15 mm。再将平板置于 28 培养箱中倒置培养 24 h，测定其抑菌圈直径14。选用的药敏纸片:红霉素、氯霉素、庆大霉素、头孢唑林、青霉素、链霉素、复方新诺明、阿米卡星、多黏菌素、氨苄西林和左氧氟沙星。1.2.7进化树分析将测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Centerfor Biotechology Information，NCBI）进行 BLAST（生物大分子序列比对），选取同源性相近的几条序列后
14、，使用 MEGA软件构建进化树。2结果2.1病蛙症状人工感染后的棘胸蛙食欲减退，活动迟缓，呆滞，头部和四肢出现皮肤溃烂，其边缘整齐，与周围正常组织界线清晰（图 1.A），溃烂导致骨骼裸露（图 1.B）。解剖观察病死蛙，腹腔内可见浅黄色的腹水，肝脏呈黑色（图 1.C），心房淤血，肠道和胃内残存少量食物。症状与自然状态下发病的棘胸蛙基本一致。对照组棘胸蛙均未出现烂皮病，并全部存活。2.2病原菌鉴定结果从病蛙皮肤溃烂处分离细菌，置于 28 环境中培养 24 h 后，观察普通琼脂培养基和沙氏培养基上的单菌落形态。菌落呈现为淡黄色、半透明的大小一致、圆形的菌落，其边缘整齐、中间微凸，表面光滑湿润，直径为
15、 0.51.5 mm。革兰氏染色后，通过显微镜观察，发现细菌为革兰氏阴性短杆状，两端稍圆钝，无芽孢。质谱鉴定结果表明该细菌为荧光假单胞菌，经鉴定该菌株用 PF 表示。PF 的 16SrRNA基因 PCR 产物经琼脂糖凝胶表2人工感染结果感染途径及组别致病率/%致死率/%皮下注射8020肌肉注射00损伤浸泡8020皮下注射（对照组）00肌肉注射（对照组）00损伤浸泡（对照组）00药物名称抑菌圈直径 d/mm敏感性链霉素26S庆大霉素26S阿米卡星39S多黏菌素26S左氧氟沙星35S氯霉素10I复方新诺明14I氨苄西林0R红霉素0R头孢唑林0R青霉素0R丽 水 学 院 学 报2023 年20电泳，
16、结果如图 2，产物大小约为 1 400 bp。PCR 产物测序结果经 NCBI BLAST（美国国家生物技术信息中心生物大分子序列比对），显示与荧光假单胞菌（AccessionNo.MN685247.1）序列一致性为 99.86%。综合革兰氏染色、质谱鉴定和 16S rRNA 基因PCR 产物测序结果，可判断该细菌的确为荧光假单胞菌。图 216SrRNA基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果2.3人工感染结果通过皮下注射和损伤浸泡这两方式感染的棘胸蛙，其致病率均为 80%，致死率均为 20%，而通过肌肉注射感染的棘胸蛙致病率和致死率均为 0（表 2）。对照组均无明显症状，无死亡情况。2.4药敏试验结果药敏实验结果表明该菌对链霉素、庆大霉素、阿米卡星、多黏菌素、左氧氟沙星高度敏感；对氯霉素和复方新诺明中度敏感；对红霉素、头孢唑林、青霉素和氨苄西林不敏感，产生耐药（表 3）。表 3药敏试验结果注：S 表示高度敏感；I 表示中度敏感；R 表示不敏感。抑菌圈直径 d20 mm 为高度敏感，10 mmd20 mm 为中度敏感，0 mm9 mm为高度敏感10,15。2.5荧光假单胞菌系统进化树分析经