1、DOI:10.13276/j.issn.2097-1656.2023.03.004军事预防医学专题己酮可可碱对叔丁基过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用刘萌萌1，2，赵晨茜2，郭鹏1，刘江正2，孔德钦2，任晓婷2，刘瑞2，海春旭2，张晓迪2(1武警后勤学院卫生勤务系，天津 300309;2空军军医大学军事预防医学系军事毒理学与防化医学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西 西安 710032)基金项目:国家自然科学基金(32100996);军事医学创新工程专项(16CXZ021);武警后勤学院基础研究项目(WHJ202015)作者简
2、介:刘萌萌，硕士，讲师，从事自由基毒理学研究，Tel:15122986193，E-mail:通信作者:张晓迪，Tel:13720767131，E-mail:zhangxiaodi 网络首发:https:/ 目的探讨己酮可可碱(PTX)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化应激和线粒体功能的影响。方法利用 t-BHP 诱导建立 HUVECs 损伤模型，PTX 预处理筛选合适的干预剂量;Mito Tracker Green、Mito SOX 和 ho 123 探针分别检测线粒体质量、活性氧(OS)和膜电位的改变;设置对照组、t-BHP 组、PTX 预处理组和单纯
3、PTX 组，对照组细胞不做处理，t-BHP 组细胞用105 mol/L t-BHP 处理，单纯 PTX 组用 1 mg/L PTX 处理，PTX 预处理组用 105 mol/L t-BHP 和 1 mg/L PTX 共同处理。采用 MTT 法检测细胞的活力;试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)和三磷酸腺苷(ATP)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力;Western blotting 法检测细胞中 SOD1、SOD2 和核转录因子相关因子 2(Nrf-2)蛋白表达水平;定磷法检测 HUVECs 细胞 Na+，K+-ATPas
4、e 和 Ca2+，Mg2+-ATPase 的活力。结果霍恩氏法计算并测得 HUVECs 在 t-BHP 暴露 6 h 的半数致死量为 105 mol/L;PTX预处理 12 h、浓度大于 1 mg/L 即可升高 HUVECs 细胞活力(P 0.05);与对照组相比，t-BHP 处理后，MitoTracker Green 和 ho 123 绿色荧光强度下降，Mito SOX 红色荧光强度升高;与 t-BHP 组相比，PTX 预处理组能提高 HUVECs 细胞活力，降低细胞培养上清中 LDH、MDA 和 GSSG 水平，细胞中 SOD 活力以及 Nrf-2 蛋白表达水平(P 0.05)，升高 HU
5、VECs 培养上清中 GSH 水平和 GSH/GSSG 比值、细胞中 SOD1 蛋白表达水平、ATP 水平以及Na+，K+-ATPase和 Ca2+，Mg2+-ATPase 活力(P 0.05)。结论PTX 对 t-BHP 诱导的 HUVECs 氧化应激和线粒体损伤有保护作用。关键词 叔丁基过氧化氢;氧化应激;己酮可可碱;线粒体 中图分类号 285 文献标志码 AProtective effect of pentoxifylline on human umbilical vein endothelial cell injury induced bytert-butyl hydroperoxid
6、eLIU Mengmeng1，2，ZHAO Chenqian2，GUO Peng1，LIU Jiangzheng2，KONG Deqin2，EN Xiaoting2，LIU ui2，HAI Chunxu2，ZHANG Xiaodi21Department of Health Service，Logistics University of Peoples Armed Police Force，Tianjin 300309，China;2Department ofMilitary Toxicology and Chemical Defense Medicine，Shaanxi Provincial
7、 Key Laboratory of Free adical Biology andMedicine，Ministry of Education Key Laboratory of Hazard Assessment and Control in Special Operational Environment，School of Military Preventive Medicine，Air Force Medical University，Xian 710032，China Abstract ObjectiveTo investigate the protective effect of
8、pentoxifylline(PTX)on oxidative stress and mitochondrialfunction in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)induced by tert-butyl hydroperoxide(t-BHP)Methodst-BHP was used to induce HUVECs injury model，and PTX was pretreated to screen suitable intervention dose.The changesof mitochondrial mass
9、，mitochondrial reactive oxygen species(OS)，and mitochondrial membrane potential were detected012http:J Air Force Med UnivVol.44 No.32023by Mito Tracker Green，Mito SOX，and ho 123 probes，respectively.Then the cells were divided into control group，t-BHP group，PTX pretreatment group and simple PTX group
10、.The control group did not receive any treatment，t-BHP groupwas treated with 105 mol/L t-BHP，simple PTX group with 1 mg/L PTX，and PTX pretreatment group with 105 mol/Lt-BHP and 1 mg/L PTX MTT assay was used to detect cell viability.The levels of lactic dehydrogenase(LDH)，malondialdehyde(MDA)，oxidize
11、d glutathione(GSSG)，reduced glutathione(GSH)，adenosine triphosphate(ATP)andthe activity of superoxide dismutase(SOD)were detected by test kits.Western blotting was used to detect the expressionlevels of SOD1，SOD2 and nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf-2)The activities of Na+，K+-ATPase a
12、ndCa2+，Mg2+-ATPase were determined by phosphate method.esultsHorns method calculated and measured the medianlethal dose of HUVECs exposed to t-BHP for 6 h was 105 mol/L.When PTX was pretreated for 12 h and the concentrationwas more than 1 mg/L，the cell viability of HUVECs was increased(P 0.05)Compar
13、ed with the control group，thegreen fluorescence intensity of Mito Tracker Green and ho 123 decreased，while the red fluorescence intensity of Mito SOXincreased after t-BHP treatment.Compared with t-BHP group，PTX pretreatment group increased cell viability，decreasedthe levels of LDH，MDA and GSSG in ce
14、ll culture supernatant，SOD activity and Nrf-2 protein expression in HUVECs(P 0.05)，and increased levels of GSH，GSH/GSSG ratio，SOD1 protein expression，ATP，and the activities of Na+，K+-ATPase and Ca2+，Mg2+-ATPase(P 0.05)ConclusionPTX can protect HUVECs from t-BHP-induced oxidativestress and mitochondr
15、ial damage.Key words tert-butyl hydroperoxide;oxidative stress;pentoxifylline;mitochondria血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)是覆盖于血管内壁上高度活跃的单层扁平或多角形细胞，广泛地分布在体内，对维持机体正常的生理功能发挥重要作用。VECs 损伤或功能紊乱，可导致高血压、冠心病和糖尿病等多种疾病的发生1。活性氧(reactive oxygen species，OS)过度产生所诱导的血管内皮损伤可能是各类心血管疾病共同的病理基础2，过量生成的 OS 导致细胞内脂质过
16、氧化物堆积、蛋白质损伤、氧化 DNA 和酶，最终导致细胞功能受损3。作为 OS 主要产生部位和攻击的主要细胞器，线粒体是维持细胞功能的重要细胞器，与细胞增殖、衰老、凋亡等基本生命活动密切相关4。己酮可可碱(pentoxifylline，PTX)是一种甲基黄嘌呤的衍生物，可改善血液循环，增加器官氧供。研究表明，PTX 具有降低新型冠状病毒肺炎患者血清乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)活力和升高淋巴细胞数量的作用5。本实验通过叔丁基过氧化氢(tert-butylhydroperoxide，t-BHP)处理制备氧化应激损伤的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型，探讨 PTX 对 HUVECs 氧化损伤和线粒体的保护作用。1材料与方法1.1材料HUVECs 来自空军军医大学病理学与病理生理学教研室;t-BHP、-actin 鼠多克隆抗体和 PTX 购自美国Sigma 公司;超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)兔多克隆抗体为美国 Abcam 公司产品;S