1、DB1304/T440-2023犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程1范围本文件规定了双重荧光定量PCR检测犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的技术要求。本文件适用于犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的快速检测和流行病学调查，肉牛和奶牛腹泻也可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用WS271-2007(感染性腹泻诊断标准
2、)3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1 PCR:合酶链式应(Polymerase Chain Reaction)3.2 RT-qPCR:量PCR(Real-time quantitative PCR)3.3 PBS:磷酸盐(Phosphate Buffered Saline)3.4Ct:环值(Cycle Threshold)3.5 DNA:脱核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)3.6 Tm值：温(Melting Temperature)44样品采集、保存、运输和处理4.1样品采集用棉拭子从犊牛直肠采集粪便，或用一次性手套采集新鲜粪便约20g,装入一次性封口袋。每份样品标记编
3、号、名称、动物来源、动物年龄、采样时间、采集单位或畜主姓名及地址。4.2样品保存和运输采集的样品在2-8条件下保存应不超过72h,长期保存需加入等体积5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内4保存。样品运输应放在一个不透水防泄漏的容器内，将上述容器置于结实、不透水和lDB1304/T440-2023防泄漏的辅助包装中。冷冻剂放在辅助包装周围，确保样品在48h内送达实验室。4.3样品的预处理4.3.1将经高压灭菌或80-100烘烤20min的60目-100目铜筛网置于无菌漏斗中，放置在固定好的铁架台上，漏斗下端置于50mL离心管中。取10g待检样品（若是成形的粪便应混匀：若粪便含水量高，混匀后取10mL
4、)放入烧杯中，加30 mL PBS,玻璃棒或压舌板混匀后经60目-100目铜筛网过滤至离心管中。4.3.2滤液用移液器吸取1.5mL放入2mL离心管中，-20保存，用于DNA提取。4.3.3剩余滤液1500r/min离心10min,弃上清。沉淀加入等体积5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内4保存备用。5操作程序5.1DNA抽提将保存于2mL离心管中的样品以1500r/min离心5min后，弃上清，沉淀用于DNA的提取，按从粪便中提取DNA的商品化试剂盒说明书进行操作。5.2荧光定量PCR检测5.2.1荧光定量PCR反应体系的配制。在反应混合物配制区进行。从试剂保存盒中取出大肠杆菌和微小隐孢子虫的上
5、下游引物及其探针2 XFastFire qPCR PreMix,灭菌超纯水，在室温下融化后，3000r/min离心5s。设定PCR数为n+2其中为待检样品数，加上一管阳性对照及一管阴性对照，每个样本测试反应体系配制（见附录B)。计算好各试剂的使用量，加入一个适当体积的离心管中，向其中加入12.5L(n+3)的2FastFireqPCR PreMix,.大肠杆菌和微小隐孢子虫上游引物各O.75L(n+3),大肠杆菌和微小隐孢子虫下游引物各0.75L(n+3),探针各0.5L(n+3),5.5L(n+3)的灭菌去离子水并充分混合均匀。向每个定量PCR管中各分装22L,转移至样本处理区。5.2.2加
6、样在样本加样区进行：在各设定的定量PC管中分别加入7.1制备的未知样本DNA溶液各3L,盖紧管盖后，500r/min离心30s。5.2.3荧光定量PCR扩增反应在样本检测区进行。将本标准7.2.2！样后的PCR管放入荧光定量PC检测仪内，记录样本摆放顺序。在96孔板记录或填写被检样品、阳性对照、阿性对照。设定双重荧光定量PR(探针法)检测大肠杆菌和微小隐孢子虫的反应参数（见附录B)。检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。6结果判定6.1结果分析条件设定检测结果有效的条件需为：同时满足(1)阴性对照FAM通道和HEX通道检测无Ct值：(2)阳性对照FAM通道和HEX通道检侧Ct值30。6.2结果判定及描述6.2.1FAM和HEX通道均检测Ct值40，则判定样品为大肠杆菌和微小隐孢子虫混合感染。2DB1304/T440-20236.2.2AM通道Ct值40，HEX通道无Ct值，则判定样品为大肠杆菌感染阳性，微小隐孢子虫感染阴性。6.2.3FAM通道无Ct值，HEX通道Ct值40，则判定样品为大肠杆菌感染阴性，微小隐孢子虫感染阳性。6.2.4FAM通道和HEX通道检测无Ct值，则判定样品为大肠杆菌和微小隐孢子虫感染阴性。7废弃物处理和防止污染的措施废弃物处理和检验过程中防止交叉污染的措施，按照WS/T230-2002中第6章“污染的预防和控制”的规定执行（见附录C)。3