1、论论著著文文章章编编号号：（）真真核核表表达达的的人人 盒盒结结合合蛋蛋白白 （）促促进进人人 肝肝癌癌细细胞胞的的增增殖殖和和迁迁移移石石烟烟祝祝，葛葛祥祥伟伟，蒋蒋琦琦炜炜，谢谢天天，米米月月，宋宋松松泽泽，张张德德宇宇，叶叶棋棋浓浓（贵贵州州大大学学医医学学院院，贵贵州州 贵贵阳阳 ；军军事事医医学学研研究究院院生生物物工工程程研研究究所所细细胞胞工工程程研研究究室室，北北京京 ；解解放放军军总总医医院院第第二二医医学学中中心心肿肿瘤瘤内内科科，北北京京 ；锦锦州州医医科科大大学学，辽辽宁宁 锦锦州州 ）收收稿稿日日期期：；接接受受日日期期：基基金金项项目目：国国家家自自然然科科学学基基
2、金金（）作作者者简简介介：石石烟烟祝祝（），女女，贵贵州州黎黎平平人人，硕硕士士研研究究生生 ：；：通通讯讯作作者者，叶叶棋棋浓浓，：；张张德德宇宇，：摘摘 要要 目目的的 构构建建带带有有 标标签签的的 盒盒结结合合蛋蛋白白 （）真真核核表表达达载载体体，转转染染至至 肝肝癌癌细细胞胞探探究究 对对肝肝癌癌细细胞胞增增殖殖和和迁迁移移的的影影响响。方方法法 以以人人卵卵巢巢文文库库为为模模板板并并采采用用 扩扩增增出出 基基因因片片段段，经经双双酶酶切切后后与与 载载体体连连接接，构构建建 真真核核表表达达载载体体；将将其其转转染染至至 细细胞胞，通通过过 法法验验证证 在在 细细胞胞的的表
3、表达达；法法和和集集落落形形成成实实验验验验证证 对对 细细胞胞生生长长的的影影响响；划划痕痕实实验验验验证证 对对 细细胞胞迁迁移移的的影影响响。结结果果 成成功功构构建建出出 真真核核重重组组表表达达载载体体，且且能能在在 细细胞胞中中表表达达 蛋蛋白白；能能够够促促进进 细细胞胞的的增增殖殖和和迁迁移移。结结论论 促促进进 细细胞胞的的增增殖殖和和迁迁移移。关关键键词词 盒盒结结合合蛋蛋白白 （）；真真核核表表达达载载体体；肝肝癌癌细细胞胞；癌癌细细胞胞细细胞胞生生物物学学；细细胞胞增增殖殖；细细胞胞迁迁移移 中中图图分分类类号号 ，文文献献标标志志码码 （），；，；，；，：；（），（）
4、；肝肝细细胞胞癌癌（，）是是最最常常见见的的原原发发性性肝肝癌癌类类型型 ，占占肝肝脏脏原原发发性性肿肿瘤瘤的的 以以上上，也也是是全全球球癌癌症症相相关关死死亡亡的的第第二二大大原原因因 。在在中中国国，每每年年约约有有 万万人人死死于于 ，占占世世界界新新发发 病病例例的的 。发发病病因因素素主主要要包包括括慢慢性性肝肝炎炎病病毒毒感感染染、肥肥胖胖、糖糖尿尿病病相相关关代代谢谢综综合合细胞与分子免疫学杂志（），（）DOI:10.13423/ki.cjcmi.009471征征等等 ，生生物物学学特特征征主主要要包包括括侵侵袭袭性性、异异质质性性和和高高复复发发性性。在在 治治疗疗上上，传传
5、统统的的手手术术切切除除、放放疗疗、化化疗疗易易复复发发，效效果果不不佳佳 。随随着着对对 不不断断的的认认识识，治治疗疗策策略略不不断断在在改改善善，但但是是 治治疗疗预预后后差差，如如果果没没有有更更高高效效的的治治疗疗方方案案，晚晚期期 的的生生存存结结果果仍仍然然是是一一个个很很严严重重的的问问题题 。因因此此，迫迫切切需需要要寻寻找找治治疗疗 靶靶标标基基因因，为为 特特供供新新的的治治疗疗方方案案。人人 盒盒结结合合蛋蛋白白（，）是是冷冷休休克克蛋蛋白白家家族族的的一一种种多多功功能能蛋蛋白白 ，和和其其他他 结结合合蛋蛋白白 和和 是是细细胞胞质质中中主主要要的的 结结合合蛋蛋白
6、白，它它们们含含有有一一个个单单一一的的冷冷休休克克域域（，），通通过过特特异异性性识识别别 ，调调节节细细胞胞增增殖殖和和核核酸酸代代谢谢 ，在在很很多多生生物物学学过过程程中中都都发发挥挥功功能能，如如转转录录和和翻翻译译调调节节、前前 剪剪接接、修修复复、耐耐药药性性、纤纤维维化化等等 。在在癌癌细细胞胞生生物物学学和和它它们们对对传传统统癌癌症症治治疗疗模模式式的的反反应应中中发发挥挥着着关关键键作作用用，与与肿肿瘤瘤进进展展、肿肿瘤瘤细细胞胞转转化化和和治治疗疗耐耐药药性性密密切切相相关关。在在许许多多转转移移性性肿肿瘤瘤中中，表表达达失失调调与与耐耐药药性性和和低低生生存存率率也也
7、有有关关系系 。由由于于许许多多癌癌症症具具有有高高水水平平的的 ，导导致致不不良良预预后后，因因此此开开发发小小分分子子抑抑制制剂剂来来阻阻止止 表表达达升升高高可可能能是是一一种种新新的的癌癌症症治治疗疗方方法法。有有研研究究发发现现，在在 患患者者中中，的的高高表表达达与与差差的的生生存存率率密密切切相相关关 ，但但是是有有关关 在在 中中的的功功能能报报道道很很少少，因因此此，本本实实验验通通过过构构建建真真核核表表达达载载体体 ，并并将将载载体体转转染染至至 肝肝癌癌细细胞胞，以以探探究究 基基因因对对肝肝癌癌细细胞胞增增殖殖及及迁迁移移的的影影响响，为为深深入入研研究究肝肝癌癌发发
8、生生发发展展提提供供新新的的研研究究机机制制奠奠定定基基础础。材材料料和和方方法法 材材料料 人人肝肝癌癌细细胞胞、人人卵卵巢巢文文库库、载载体体以以及及相相关关常常规规试试剂剂均均由由军军事事科科学学院院军军事事医医学学研研究究院院生生物物工工程程研研究究所所叶叶棋棋浓浓课课题题组组提提供供；引引物物及及测测序序由由北北京京博博迈迈德德生生物物公公司司合合成成；试试剂剂盒盒、限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶 和和 、酶酶切切试试剂剂盒盒及及 连连接接酶酶购购自自宝宝日日医医生生物物技技术术（北北京京）有有限限公公司司（）公公司司；琼琼脂脂糖糖胶胶、胶胶回回收收试试剂剂盒盒、培培养养基基、质质
9、粒粒提提取取试试剂剂盒盒购购自自普普洛洛麦麦格格（北北京京）生生物物技技术术有有限限公公司司；氨氨苄苄青青霉霉素素（，）、感感受受态态细细胞胞、菌菌液液 试试 剂剂 盒盒、改改 良良 基基 础础 细细 胞胞 培培 养养（，）、胎胎牛牛血血清清（，）购购自自 公公司司；青青霉霉素素、链链霉霉素素、转转染染试试剂剂 购购自自威威格格拉拉斯斯生生物物技技术术 有有 限限 公公 司司；辣辣 根根 过过 氧氧 化化 物物 酶酶（，）标标记记的的 肌肌动动蛋蛋白白（）和和 标标 记记 的的 （）抗抗 体体 购购 自自 公公司司；试试剂剂盒盒购购自自 公公司司；二二辛辛可可宁宁酸酸（，）蛋蛋白白浓浓度度测测
10、定定试试剂剂盒盒购购自自北北京京博博迈迈德德基基因因技技术术有有限限公公司司。方方法法 真真核核表表达达载载体体的的构构建建与与鉴鉴定定 从从 查查找找获获得得人人源源 基基因因的的编编码码区区序序列列（，），通通过过 软软件件设设计计引引物物，上上游游引引物物为为 ；下下 游游引引物物为为 ；划划线线区区酶酶切切位位点点为为 和和 ，基基因因 扩扩增增模模板板为为卵卵巢巢文文库库，扩扩增增体体系系为为 体体系系，扩扩增增条条件件为为：预预变变性性 ；（变变性性 ，退退火火 ，延延伸伸 ）个个循循环环，延延伸伸 。获获得得 基基因因 扩扩增增产产物物后后，进进行行琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳。
11、将将约约 大大小小条条带带进进行行胶胶回回收收，再再用用 和和 双双酶酶切切 产产物物和和 载载体体，用用 连连接接酶酶将将两两者者进进行行酶酶连连接接，连连接接条条件件为为 过过夜夜连连接接；利利用用 感感受受态态细细胞胞转转化化连连接接产产物物，在在含含有有 抗抗性性的的固固体体 涂涂板板，倒倒置置过过夜夜培培养养。挑挑取取单单克克隆隆菌菌落落，在在含含有有 抗抗性性 液液体体培培养养基基中中扩扩大大培培养养，并并进进行行菌菌液液 和和测测序序鉴鉴定定。利利用用质质粒粒提提取取试试剂剂盒盒提提取取阳阳性性克克隆隆的的菌菌液液为为质质粒粒，可可用用于于后后续续实实验验。细细胞胞培培养养 肝肝
12、癌癌细细胞胞用用含含 、青青霉霉素素、链链霉霉素素的的 培培 养养 基基 培培 养养，培培 养养 条条 件件 为为 、。细细胞胞贴贴壁壁后后更更换换培培养养基基继继续续培培养养；待待 细细胞胞稳稳定定长长至至 代代后后，用用于于后后续续实实验验。法法检检测测 细细胞胞 蛋蛋白白表表达达 按按照照 的的细细胞胞汇汇合合度度，分分别别将将 肝肝癌癌细细胞胞均均匀匀接接种种到到 个个 培培养养皿皿中中，待待细细胞胞贴贴壁壁后后更更换换培培养养基基。后后，按按照照转转染染体体系系（、青青霉霉素素、链链霉霉素素的的 培培养养 基基、真真 核核 表表 达达 载载 体体、）将将 真真核核表表达达载载体体和和
13、 空空载载体体转转染染至至 肝肝癌癌细细胞胞系系中中。转转染染步步骤骤：将将 与与 混混匀匀静静置置 ，与与真真核核表表达达载载体体充充分分混混匀匀后后再再静静置置 ；加加入入 培培养养皿皿中中混混匀匀，置置于于 培培养养箱箱中中培培养养；后后，更更换换完完全全培培养养基基；再再培培养养 后后，收收集集细细胞胞。加加入入 倍倍细细胞胞量量细细胞胞裂裂解解液液 期 石烟祝，等 真核表达的人 盒结合蛋白（）促进人 肝癌细胞的增殖和迁移 ，吹吹打打均均匀匀后后冰冰浴浴 ；加加入入与与细细胞胞裂裂解解液液等等量量的的 上上样样缓缓冲冲液液，沸沸水水浴浴 ；离离心心 后后，取取上上清清液液，进进行行 ；
14、，转转硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜 ，。转转膜膜结结束束后后，用用 脱脱脂脂牛牛奶奶封封闭闭 。洗洗膜膜 次次（每每次次 ），用用洗洗脱脱液液洗洗脱脱后后，加加 （）和和 抗抗体体（），过过夜夜孵孵育育；化化 学学 发发 光光 法法 显显 色色 压压 片片 ，显显 影影，检检 测测 融融合合蛋蛋白白的的表表达达。法法检检测测 对对 细细胞胞生生长长的的影影响响 采采用用 试试剂剂验验证证 对对肝肝癌癌 细细胞胞的的影影响响，按按照照转转染染体体系系将将真真核核表表达达载载体体 和和 空空载载体体分分别别转转染染至至 肝肝癌癌细细胞胞。继继续续培培养养 后后，按按照照每每孔孔 个个细细胞胞接接种种至
15、至 孔孔板板中中，每每组组设设置置 个个重重复复。在在 波波长长下下测测量量第第、天天的的吸吸光光度度（）值值。吸吸弃弃细细胞胞上上清清培培养养基基，每每孔孔加加入入 完完全全培培养养基基（含含 试试剂剂），置置于于 培培养养箱箱孵孵育育 。用用酶酶标标仪仪检检测测 值值，以以培培养养时时间间作作为为横横坐坐标标，纵纵坐坐标标绘绘制制生生长长曲曲线线，以以评评估估 对对 生生长长的的影影响响。克克隆隆形形成成实实验验检检测测 对对 细细胞胞增增殖殖的的影影响响 采采用用克克隆隆形形成成实实验验验验证证 对对 肝肝癌癌细细胞胞增增殖殖的的影影响响，按按照照转转染染体体系系将将真真核核表表达达载载
16、体体 和和 空空载载体体分分别别转转染染至至 细细胞胞。继继续续培培养养 后后，按按照照 个个 孔孔的的细细胞胞数数接接种种于于 孔孔板板中中，每每组组设设置置 个个重重复复，置置于于 孵孵育育箱箱中中培培养养。直直至至肉肉眼眼可可见见克克隆隆形形成成即即可可终终止止培培养养（约约 周周），吸吸弃弃原原培培养养基基，洗洗净净后后，加加入入 多多聚聚甲甲醛醛固固定定细细胞胞。再再用用 结结晶晶紫紫染染色色，计计数数克克隆隆形形成成数数，检检测测 对对 细细胞胞增增殖殖的的影影响响。划划痕痕实实验验检检测测 对对 细细胞胞迁迁移移能能力力的的影影响响 采采用用划划痕痕实实验验验验证证 对对肝肝癌癌 细细胞胞迁迁移移能能力力的的影影响响，按按照照转转染染体体系系将将真真核核表表达达载载体体 和和 空空载载体体分分别别转转染染至至 细细胞胞。继继续续养养 后后，对对细细胞胞进进行行划划痕痕，用用 洗洗净净残残余余细细胞胞，加加入入新新鲜鲜的的完完全全培培养养基基。用用显显微微镜镜随随机机选选择择 个个初初始始位位置置拍拍照照并并进进行行标标记记，继继续续置置于于 培培养养箱箱中中培培养养 ，并