1、2023年第42卷第1期食品与生物技术学报陈 宁，等：蔗糖异构酶在异麦芽酮糖生产中的研究进展综 述Research Progress of Sucrose Isomerase in Isomaltulose ProductionCHEN Ning1,2，ZHANG Jiayu1,2，ZHENG Mingqiang1,2，LU Fuping1,2，LIU Fufeng*1,2(1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education/Tianjin Key Laboratory ofIndustr
2、ial Microbiology/National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China;2.College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)Abstract：Isomaltulose is a new multifunctional sweetener and an international
3、ly recognized safesucrose substitute.Isomaltulose has wide application prospects in the medicine and food industries.Sucrose isomerase(SIase)is the most effective biological enzyme reagent for the production ofisomaltulosebybiologicaltransformation.Thisreviewbrieflypresentsthephysiologicalcharacteri
4、stics of isomaltulose as well as the existing problems in its production.The source,three-dimensional structure,catalysis mechanism,rational design of high efficient enzymes andheterologous efficient expression of SIase were discussed in detail.In addition,the wide applicationof cell and enzyme immo
5、bilization in the production of isomaltulose was then introduced.Finally,the application of SIase in isomaltulose production was prospected.Keywords:sucrose isomerase,immobilization,isomaltulose,heterologous expression,rationaldesign摘要：异麦芽酮糖是一种多功能的新型甜味剂，同时也是国际上公认安全的蔗糖替代品，在医药、食品等行业中具有广阔的应用前景。蔗糖异构酶（su
6、crose isomerase，SIase）是生物转化生产异麦芽酮糖最有效的生物酶制剂。作者简要论述了异麦芽酮糖的生理特性及其在生产中现存的问题，详细阐述了SIase的来源、三维结构、催化机制、高效酶分子理性改造及其异源高效表达等。随后介绍了细胞及酶固定化在异麦芽酮糖生产中的广泛应用，并展望了蔗糖异构酶在生产异麦芽酮糖中的应用。关键词：蔗糖异构酶；固定化；异麦芽酮糖；异源表达；理性设计中图分类号：Q 558文章编号：1673-1689（2023）01-0055-11DOI：10.3969/j.issn.1673-1689.2023.01.004蔗糖异构酶在异麦芽酮糖生产中的研究进展陈 宁1，2
7、，张佳钰1，2，郑明强1，2，路福平1，2，刘夫锋*1，2（1.天津科技大学 工业发酵微生物教育部重点实验室/天津市工业微生物重点实验室/工业酶国家工程实验室，天津300457；2.天津科技大学 生物工程学院，天津300457）收稿日期：2022-05-15基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFC2102700）；国家自然科学基金项目（32272269）；天津市区域创新项目（21ZYQCSY00050）。*通信作者：刘夫锋（1977），男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事工业酶分子理性设计研究。E-mail：综 述55CHEN Ning，et al：Research Progress
8、 of Sucrose Isomerase in IsomaltuloseProductionJOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023Review随着社会经济的提高与健康意识的发展，人们越来越关注高质量的健康生活，低热量及零蔗糖食品饮料逐渐成为重要的消费产品。此外，肥胖、高血糖、龋齿等健康问题也增加了消费者对低糖食品的消费倾向，异麦芽酮糖作为替代蔗糖的功能性甜味剂而受到广泛关注1-3。异麦芽酮糖（isomaltulose），即6-O-D-吡喃葡糖基-D-果糖，又称帕拉金糖，是蔗糖的一种异构体，与蔗糖有着相似的物理
9、性质和口感4。异麦芽酮糖是通过果糖和葡萄糖以-1，6糖苷键相连后得到的右旋双糖。自然状态下，异麦芽酮糖是以白色结晶状态存在的。异麦芽酮糖的甜度大约是蔗糖的50%，且无任何异味，甜味稳定，将异麦芽酮糖放在高温环境（120）中熬煮一段时间，甜味几乎没有变化2。异麦芽酮糖易溶于水，且随着温度的升高其溶解度逐渐变大3。与蔗糖相比，异麦芽酮糖的耐酸性较强，将20 g/dL的蔗糖和异麦芽酮糖在酸性条件下的沸水浴中处理一定时间后，蔗糖全部水解，而异麦芽酮糖几乎没有变化5。由于异麦芽酮糖的吸湿性较差，不易降解，尤其是在柠檬酸的存在下，其可在室温条件下长时间的保存。异麦芽酮糖还有一定的保健功能。研究发现，当摄入
10、的食物中添加了异麦芽酮糖时，可有效减少口腔疾病的发生5，且唾液中可变链球菌的数量也明显减少6，且异麦芽酮糖可在小肠内完全消化、吸收，由于异麦芽酮糖的分解速度很慢，体内胰岛素和血糖可长时间保持在一定范围内，不会造成血液中葡萄糖水平极速上升，可有效预防糖尿病，适合糖尿病患者摄入7-8。另外，异麦芽酮糖还可通过加氢反应生产糖醇9，其可作为无糖替代品应用于食品中。异麦芽酮糖以其良好的酸稳定性、极低的吸湿性和较高的安全性10-11，在食品中具有广阔的市场应用前景。异麦芽酮糖广泛的优势和适用人群，使其具有重要的开发价值。甜菜和蜂蜜中存在天然的异麦芽酮糖，但其含量较少且提取困难，难以满足市场需求。因此，为了
11、满足市场供给需要，亟须提高异麦芽酮糖的生产效率。目前，异麦芽酮糖的制备方法主要有化学转化法和生物转化法。由于化学转化法存在耗能高、污染性强等问题12，而且技术不够成熟，使得制备异麦芽酮糖变得非常困难。因此，包括酶转化法和微生物转化法在内的生物转化法在国内外得到了广泛的应用。生物转化法是基于蔗糖异构化法转化生成异麦芽酮糖，即利用微生物合成的蔗糖异构酶（sucrose isomerase，SIase，EC 5.4.99.11）将蔗糖分子中葡萄糖和果糖之间的-1，2糖苷键异构化为-1，6糖苷键形成异麦芽酮糖和-1，1糖苷键形成海藻酮糖13。因此，蔗糖异构酶是生物催化生成异麦芽酮糖和海藻酮糖最有效的生
12、物酶制剂，通过蔗糖异构酶生物转化法实现异麦芽酮糖产业化受到人们越来越多的关注。作者综述了蔗糖异构酶的研究进展，详细介绍了SIase的来源、三维结构、催化机制、理性改造和异源表达等，以及在异麦芽酮糖制备中细胞固定化和酶固定化的固定化技术，最后展望了蔗糖异构酶在异麦芽酮糖工业化生产中的广阔市场前景。1.1蔗糖异构酶的来源20世纪50年代，南德公司首次在甜菜厂的废水中分离得到能够分泌蔗糖异构酶的红色精朊杆菌（Protaminobacter rubrum），进而发明了采用微生物酶转化法制备异麦芽酮糖。经过几十年的研究发展，科研人员已经分离获得多种能够合成蔗糖异构酶的微生物，且绝大部分蔗糖异构酶都来源于
13、细菌。能产蔗糖异构酶的代表细菌有：普城沙雷氏菌14、放射性土壤杆菌15、大黄欧文菌16、分散泛菌17、克雷伯氏肺炎菌18以及嗜中酸假单胞菌19。根据酶催化生成的主要产物，蔗糖异构酶分为：主要生产异麦芽酮糖型（转化率为60%90%）和主要生产海藻酮糖型（转化率为85%89%）。此外，一种来源于昆虫Silverleaf whitefly的蔗糖异构酶20催化蔗糖只生成海藻酮糖。1.2蔗糖异构酶的酶学性质蔗糖异构酶的pI小于7，属于酸性蛋白质，最适pH在5.57.0。当pH超过此范围时，其活性显著降低。同时，催化口袋的电荷对催化反应的最终产物影响显著。当反应的pH高于酶的最适pH时，最终产物中海藻酮糖
14、的比例上升；而当反应的pH低于酶的最适pH时，催化产物中葡萄糖和果糖的产量增加21。大多数蔗糖异构酶的最适温度在2040，且蔗糖异构化产物的比例受温度影响很大。高温条件有利于异麦芽酮糖的形成，而较低的反应温度则有利于海藻酮糖的生成。一般来说，反应温度的升蔗糖异构酶的概述1562023年第42卷第1期食品与生物技术学报陈 宁，等：蔗糖异构酶在异麦芽酮糖生产中的研究进展综 述高加快了反应速度。然而，高温条件（50）会加剧蔗糖的水解，并生成葡萄糖和果糖。不同来源的蔗糖异构酶的动力学参数不同，其底物亲和力和识别能力也是不同，如嗜中酸假单胞菌（Pseudomonasmesoacidophila）中蔗糖异
15、构酶Km值为19.2 mmol/L22，大黄欧文菌（Erwinia rhapontici）中蔗糖异构酶的Km值是其10倍左右，达到222 mmol/L23。同样的，红色精朊杆菌P.rubrum CBS574.77的Kcat/Km值为1 301 L/（smmol）24，而P.mesoacidophila MX-45的Kcat/Km值仅为36 L/（smmol）25。此外，不同的金属离子对蔗糖异构酶的影响也存在差异，Mn2+和Mg2+的存在可促进酶活力的提升，Ca2+、Cu2+、Zn2+的存在会使酶活力受到微弱抑制，而当Ag+、Hg+存在时酶完全失活。同时，蔗糖异构酶对蔗糖具有高度的底物特异性，当
16、反应体系中存在葡萄糖和果糖时，葡萄糖和果糖则变为该酶的竞争性抑制剂，使酶的底物亲和力降低26。1.3蔗糖异构酶的三维结构在蛋白质数据库（PDB）里，目前利用X射线衍射法已成功解析了4种蔗糖异构酶的三级结构，分别 是 来 源 于Klebsiella sp.LX3（PDB：1M53）18、Protaminobacter rubrum CBS574.77（PBD：3GBD）27、Pseudomonas mesoacidophila MX-45（PBD：1ZJA）22和Erwinia rhapontici NX-5（PBD：4HOW）28的蔗糖异 构 酶。其 中，P.mesoacidophila MX-45和E.rhapontici NX-5蔗糖异构酶突变体的结构以及其抑制剂结合体的结晶结构也得到全面解析19，28。作为单亚基分子的蔗糖异构酶，其分子结构和糖苷酶13（GH13）家族的酶分子结构类似，如寡-1，6-葡萄糖苷酶和-葡萄糖苷酶29，而且不同来源的蔗糖异构酶的三级结构同源性也很高25。与GH13家族酶相比，蔗糖异构酶也是由3个结构域组成，包括C端结构域、N端结构域和亚结构域30。其中，