1、检测技术NO.02 2023113饲料研究 FEED RESEARCH优化高效液相色谱测定玉米青贮饲料中有机酸条件的研究刘瑞芳 王艺伟（西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100）摘要：研究旨在优化高效液相色谱仪测定玉米青贮饲料中有机酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量的最佳条件。试验以玉米青贮为试验材料，优化高效液相色谱法中的流动相配比、流速及柱温等条件，从而提高有机酸分离效果，缩短检测时间。结果显示，在甲醇KH2PO4（0.01 mol/L）=1090、流速1.0 mL/min、柱温30 的条件下，青贮饲料中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分别为2.618、1.569、0.712、0.0
2、56 g/L，检测结果的变异系数为1%3%，样品回收率为99.7%102.5%，标准偏差（RSD）为0.16%0.34%。研究表明，优化后的条件测定玉米青贮饲料中4种有机酸的分离效果理想，精密度高，回收率好。关键词：高效液相色谱；有机酸；玉米青贮中图分类号：S 816.5 文献标识码：A 文章编号：1002-2813（2023）02-0113-04 Doi：10.13557/ki.issn1002-2813.2023.02.023Optimization of conditions for determination of organic acids in corn silage by HPL
3、CLIU Rui-fang WANG Yi-weiAbstract:The study was to optimize the optimum conditions for simultaneous determination of organic acids(lactic acid,acetic acid,propionic acid and butyric acid)in corn silage by HPLC.Corn silage was used as the test material to optimize flow compatibility ratio,flow veloci
4、ty and column temperature in HPLC,to improve the separation effect of organic acids and shorten detection time.The results showed that under the conditions of methanolKH2PO4(0.01 mol/L)=1090,flow rate 1.0 mL/min and column temperature 30,the content of lactic acid,acetic acid,propionic acid and buty
5、ric acid in silage were 2.618,1.569,0.712 and 0.056 g/L,respectively,and the coefficient of variation of test results were 1%3%.The recoveries were 99.7%102.5%,and RSD were 0.16%0.34%.The study indicates that the optimized conditions for the determination of four kinds of organic acids in silage hav
6、e ideal separation effect,high precision and good recovery.Key words:HPLC;organic acids;corn silage有机酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）是饲料青贮过程中微生物作用下的产物1。乳酸是反映青贮质量的重要指标，乳酸和乙酸是导致青贮过程中pH值下降的主要因素；丙酸具有抑制真菌的作用，可防止二次发酵；丁酸与青贮饲料腐败程度有关。有机酸含量是评定青贮饲料质量的重要指标2-3。青贮饲料中有机酸检测方法有酶法、薄层色谱法、气相色谱法、离子色谱法、高效液相色谱法等4-6。高效液相色谱法因具有操作简单、准确度高、可以同时
7、测定多种有机酸等优点而广泛应用。本试验旨在优化测定4种有机酸定性、定量检测的高效液相色谱检测方法，为相关研究与应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料玉米青贮由西北农林科技大学实验教学基地提供，采用四分法进行采样。1.2主要试剂乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醇、乙腈，均购自北京预维科技有限公司；磷酸、磷酸二氢钾，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；试验用水为超纯水。1.3主要仪器Hitachl-2000 高效液相色谱分析仪购自日立公司，7693A 进样器、LC2030 紫外检测器购自安捷伦公司，Millipore超纯水机购自默克密理博有限公司，Allegra高速离心机购自克曼公司，ATY220分析天
8、平购自岛津有限公司，KQ-600E超声波清洗器购自山市超声仪器有限公司，PHS-3C pH计购自赛多利斯科学仪器（北京）公司，ZDP-250恒温振荡箱购自上海精宏实验设备有限公司。第一作者：刘瑞芳，硕士，实验师，研究方向为动物营养与饲料科学。基金项目：西北农林科技大学实验技术研究项目（项目编号：SY20210228）；西北农林科技大学教学改革研究项目（项目编号：JY2103043）收稿日期：2022-04-29检测技术NO.02 2023114饲料研究 FEED RESEARCH1.4试验方法1.4.1标准曲线的绘制配制不同质量浓度的乳酸、乙酸（1、2、3、4、5 g/L），丙酸、丁酸（0.1
9、、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）的混合标样，经0.45 m的微孔膜过滤。上机测试分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，计算相关系数。1.4.2色谱分离条件的优化1.4.2.1流动相配比的选择Agilent TC-C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m），紫外检测波长210 nm。0.01 mol/L KH2PO4缓冲溶液为水相，甲醇和0.01 mol/L KH2PO4分别为流动相A和B，将流动相 A 和 B 的比例分别设为 199、397、595、1090，流动相使用0.45 m的纤维素膜过滤，超声波脱气。柱温25，流速1.0 mL/min，进
10、样量20 L。根据有机酸分离情况筛选流动相最佳配比。1.4.2.2流速的选择在 1.4.2.1 确定的最佳流动相配比的基础上，使用0.45 m 的纤维素膜过滤流动相，超声波脱气。柱温25，分别设置流速为0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，进样量20 L。根据有机酸分离情况筛选最佳的流速。1.4.2.3柱温的选择在1.4.2.2确定的最佳流速的基础上，分别设置柱温为20、25、30、35，进样量20 L。根据有机酸的分离情况筛选最佳的柱温。1.4.3精密度测定取有机酸混合标准溶液，按照优化后的色谱条件上机检测，连续上样6次，计算变异系数。1.4.4回收率测定取适量试样浸提液，分成4份，
11、其中一份直接上机测定，其余3份中加入不同质量浓度的标准液，按照优化后的色谱条件上机检测，连续 3 次，测定加标回收率5。加标回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量100%(1)1.4.5试样有机酸测定准确称取新鲜玉米青贮饲料25 g于250 mL具塞三角瓶中，加200 mL超纯水，于恒温振荡箱4、120 r/min振荡 24 h，4 层纱布过滤提取液，快速定量滤纸，0.45 m微孔膜过滤；过滤后的浸提液按照优化后的色谱条件上机测定，每个试验测定5次，具体步骤参照孙蕊等7和王珍珍等8的方法进行。2结果与分析2.1标准曲线绘制与计算（见图1、表1）由图1可知，乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的出峰时
12、间依次为6.194、6.976、13.152、30.016 min。根据各有机酸的峰面积计算有机酸的质量浓度，以有机酸的质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，建立回归方程并计算相关系数。2.2色谱分离条件的优化结果2.2.1流动相配比对高效液相色谱分离效果的影响（见图2、图3）流动相AB为397和595时，有机酸的分离效果与AB为199峰型和出峰时间基本相同。由图2、图3可知，当流动相AB=199时，有机酸出峰较早，丙酸和丁酸分离，仅24 min完成4种有机酸检测；当流动相AB=1090时，有机酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）分离效果好，峰形对称，峰面积稳定。2.2.2 流
13、速 对 高 效 液 相 色 谱 分 离 效 果 的 影 响（见图4图6）图1高效液相色谱测定标样中有机酸图谱表1高效液相色谱测定标样中有机酸含量的标准曲线 项目乳酸乙酸丙酸丁酸回归方程y=719.153 5x227.50y=819.294 8x144.33y=794.631 6x756.18y=687.451 2x594.23相关系数（R2）0.994 60.992 40.998 70.995 4图2流动相A B=1 99高效液相色谱图图3流动相A B=10 90高效液相色谱图检测技术NO.02 2023115饲料研究 FEED RESEARCH流速为0.8 mL/min时，有机酸分离效果和检
14、测时间与流速为0.6 mL/min基本相同。由图4图6可知，当流速为0.6 mL/min时，基线漂移，有机酸分离效果不佳，检测时间较长；当流速为1.2 mL/min时，出峰早，乳酸和乙酸分离效果差，检测时间短；流速为 1.0 mL/min时，有机酸出峰时间适宜，分离效果好，峰形对称且稳定。2.2.3 柱 温 对 高 效 液 相 色 谱 分 离 效 果 的 影 响（见图7、图8）柱温为25 时，有机酸的分离效果与柱温为20 时基本相似；柱温为35 有机酸的分离效果与柱温为30 基本相似。由图7、图8可知，柱温为20 时，4种有机酸的出峰时间为5.986、6.132、11.958、32.655 m
15、in，乳酸和乙酸的分离效果不佳。随着温度升高，分离效果明显提高，分离时间明显缩短；当柱温为30，4种有机酸出峰时间提早为5.893、5.989、11.486、28.832 min，分离效果好，峰形对称。2.3高效液相色谱测定标样中有机酸含量结果（见表2）由表2可知，4种有机酸测定结果的变异系数为1%3%，表明该测定方法具有较好的精密度，与赵欣等9、许庆方等10研究结论一致。2.4青贮饲料样品有机酸高效液相色谱及回收率测定结果（见图9、表3）由图9、表3可知，青贮饲料中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分别为 2.618、1.569、0.712、0.056 g/L，样品回 收 率 均 在 99.7%10
16、2.5%范 围 内，RSD 为 0.16%0.34%，均小于5%。研究表明，该检测体系的稳定性好，可满足 4 种有机酸检测的要求，与王彦平等11、赵艳等12、银燕等13结论一致。图4流速为0.6 mL/min时高效液相色谱图图5流速为1.2 mL/min时高效液相色谱图图6流速为1.0 mL/min时高效液相色谱图图7柱温为20 的高效液相色谱图图8柱温为30 的高效液相色谱图表2高效液相色谱测定标样中有机酸含量结果 单位：g/L序号123456平均值标准偏差变异系数乳酸2.980 62.998 22.948 73.099 42.939 62.941 62.984 70.065 22.18乙酸3.118 83.130 83.125 43.129 93.131 83.115 73.125 40.057 41.84丙酸2.017 92.019 82.038 42.021 21.999 82.048 42.024 30.036 11.78丁酸2.009 92.010 52.099 72.067 92.000 31.999 72.031 30.044 12.17图9青贮饲料样品中有机酸的高效液