1、西 北 农 业 学 报 ，（）：油菜（），木糖基转移酶基因 克隆、序列分析及亚细胞定位收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（，）；甘肃省科技计划重大项目（）；甘肃省农科院院列现代生物育种专项（）；甘肃省农科院院列重点研发计划（）。第一作者：董云，男，博士，副研究员，主要从事油菜育种研究。：通信作者：吴旺泽，男，博士，副教授，主要从事油菜冷冻适应性机制研究。：董云，吴旺泽，靳丰蔚，方彦，刘婷婷，王毅，徐一涌，杨晓明（甘肃省农业科学院 作物研究所，兰州 ；西北师范大学 生命科学学院，兰州 ；甘肃农业大学，省部共建干旱生境作物学国家重点实验室，兰州 ）摘要糖基转移酶（，）广泛参与植物次生物
2、质的代谢及生物和非生物胁迫，木糖基转移酶属于糖基转移酶 家族成员。为了探究油菜，木糖基转移酶对油菜次生物质的代谢和逆境调控，利用 和 方 法 从 甘 蓝 型 油 菜 中 扩 增 获 得 油 菜，木 糖 基 转 移 酶 基 因 全长 ，该 具有 的完整开放阅读框，编码 个氨基酸，分子质量约 ，由 个原子组成，分子式为 ，具有多个磷酸化位点和糖基化修饰位点，属非分泌性单次跨膜蛋白。结构域分析表明，具有 家族保守的 保守结构域和 糖基转移酶 特征结构域，属于糖基转移酶 家族成员。亚细胞定位初步显示 定位于细胞质中，蛋白互作预测表明 与各类糖合成和转运蛋白高度互作。结构域预测和互作分析初步表明，属于油
3、菜糖基转移酶 家族成员，可能通过与糖合成和转运相关蛋白互作参与油菜木糖的合成代谢进而参与生长发育及逆境响应。关键词，木糖基转移酶；甘蓝型油菜（）；生物信息学；亚细胞定位糖基转移酶（，）广泛存在于原核生物、真核生物、古细菌及病毒中，具有催化蛋白质、糖类、脂质、激素、黄酮等物质进行糖基化的功能。通过糖基化反应能使特定的糖基集团从一些供体转移到靶受体形成糖苷等次生代谢物。另外，糖基转移酶还能催化各类糖转变为各种受体分子，改变受体分子的稳定性，水溶性以及受体分子的生物活性和转运能力，从而介导植物生长发育、次生物质代谢、生物及非生物胁迫响应。在植物体内，免疫相关复合物如水杨酸、酚类化合物、硫配糖体等三萜
4、类化合物合成的最后修饰步骤就是糖基化过程。通过全基因组数据分析，发现真核生物基因组里大概有的基因编码糖基转移酶。目前，根据 序列的相似度以及催化底物的特异性和催化产物的立体化学结构，在碳水化合物 活性 酶 数 据 库 （）中，已经发现 个糖基转移酶家族（），其中 家族包含最多的家族成员。戊糖和 己糖是糖基转移酶 家族大多成员的反应底物，其中 糖基转移酶（）是催化 糖的糖基转移酶。在模式植物拟南芥中已经发现 多个糖基转移酶基因，在芸薹属物种甘蓝型油菜（）、甘 蓝（）和 白 菜（）中已经分别鉴定 、个 糖基转移酶基因，这些糖基转移酶主要参与次生代谢物质的合成、生物和非生物胁迫。例如 和 在拟南芥中
5、通过 关 联茉 莉 酸 和 水杨酸来响应假单胞菌侵染，拟南芥 和 能通过改变吲哚衍生物参与盐与活性氧胁迫抗性。被发现在甘蓝型油菜中通过抑制芥子酸来响应非生物胁迫。蔡明亮等 从贵州地方稻种平塘黑糯（）低温转录组文库中，筛选到一个响应低温的糖基转移酶基因 ，初步的表达分析认为该基因能被低温诱导，与日本晴（）栽培种相比，序列具有丰富的 多态性。中药材植物中，像黄酮类化合物、咖啡酸及其衍生物等次生代谢物，对药性及药材道地性极其重要，在这些次生代谢物的合成过程中，糖基转移酶具有重要的作用。例如在新疆紫草咖啡酸及其衍生物合成过程中，葡萄糖基转移酶（，）调节的苯丙烷途径发挥了重要作用。黄酮类化合物是三七重要
6、的药性成分，重组蛋白试验发现三七糖基转移酶 在体外能催化黄酮糖苷化产物的合成。这些证据充分证明，糖基转移酶在植物生长发育，尤其是生物、非生物胁迫中具有重要功能。因此深入了解油菜中糖基转移酶的生物学功能，通过遗传学和生物技术等手段提高油菜品质和逆境抗性具有重要的理论意义和应用价值。油菜是中国重要的油料作物之一，同时也是发展生物能源的优良经济作物。油菜生长发育过程中经常受到高温、干旱、冻害、病害、虫害等逆境的影响，造成油菜产量和品质严重下降 。鉴定，挖掘抗逆相关的基因和（，），是分子标记辅助选育高抗油菜新品种的先决条件。但与传统模式植物拟南芥和水稻等相比，在油菜中与品质和抗逆相关的基因功能研究相对
7、落后。本研究利用 和 技术从甘蓝型油菜（）中扩增了，木糖基转移酶基因 （）的 端和 端序列，拼接后获得该基 因 的 全 长 序 列（登 记 号 ，命名为 ），对其全序列进行生物信息学分析，并通过构建融合表达载体 ，利用烟草瞬时表达系统进行 亚细胞定位，为将来进一步研究，木糖基转移酶基因 在油菜次生物质代谢及逆境响应中的生物学功能奠定理论基础。材料与方法 材 料 植物材料参试油菜为甘蓝型（）栽培品种 ，烟草为本氏烟草（）。菌株和载体农杆菌 、大肠杆菌（）感受态细胞 、植物表达载体 、克 隆 载 体 购自陕西博瑞德生物科技公司。酶、试剂盒和主要的化学试剂 聚合酶 、胶回收试剂盒（）、限制性内切酶
8、、，购自陕西博瑞德生物科技公司；试剂盒和 均购自 公 司；试剂盒购自 公司。方 法 油菜总 的提取油菜总 采用 法提取，提取方法参考其说明书。油菜，木糖基转移酶基因 克隆根据 中已登记的甘蓝型油菜，木糖基转移酶基因保守区序列（：），设 计 和 引物，引物由上海生物工程公司合成，相关引物序列见表。以总 为模板，使用 试 剂 盒 和 试剂盒分别进行 端序列和 端序列扩增，反转录及 扩增均参照试剂盒说明进行。将 和 第轮 产物分别进行电泳，对目的片段的回收、连接、转化，挑取阳性克隆送上海生物工程公司测序。利用 软件拼接 和 扩增获得的 端、端片段序列和原来的保守区序列。油菜，木糖基转移酶基因 生物
9、信 息 学 分 析利 用 （：）预测 氨基酸序 列 分 子 量 和 等 电 点。利 用 中 的 ，分别进行 蛋白保守性、糖基化位点、磷酸化位点、蛋白信号肽、跨膜结构、蛋白质三级结构和互作蛋白的预测；利用 软件同源比对芸薹属物种 氨基酸序列。期董云等：油菜（），木糖基转移酶基因 克隆、序列分析及亚细胞定位表 和 引物序列 引物名称 序列（）油菜，木糖基转移酶基因 融合表达载体构建通过 软件查找拼接后基因全长的开放阅读框，在起始密码子和终止密码子附近设计开放阅读框的上下游引物 、。因克隆的基因序列较长，为保证克隆 的 片 段 无 突 变，在 序 列 中 间 设 计 引 物 、，分别与上下游引物配对
10、进行 扩 增，引物 序 列 见 表。反应体系：模表克隆的相关引物序列 引物名称 序列（）片段大小 板 ，（），（），（），（），。反应条件：预变性 ；循环为 变性，退火，延伸 ，共 个循环；延伸 。参照胶回收试剂盒（）、克隆载体 的使用说明书回收目的片段，并分别与 载体连接。按照董云等 的方法进行连接产物的转化、质粒抽提，使用 和 ，和 进行双 酶 切 鉴 定，双 酶 切 体 系：，质粒 ，或 （），（），。分 别 用 和 ，和 ，和 将鉴定正确的重 组 质 粒 和 植 物 表 达 载 体 质粒进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收及纯化（方法同前）。对胶回收的目的基因两个片段及载体 大
11、片段进行体外连接（图）、转化大肠杆菌 感受态细胞，在含 的 固体培养基中培养；再将转化出来的单菌落通过摇菌后用 进行菌液 鉴定，鉴定正确的菌液送测序并保存菌液。油菜，木糖基转移酶 亚细胞定位参照郝丽芬等 的方法，构建的融合表达载体 导 入 农 杆 菌 ，并瞬时转染本氏烟草叶片，侵染后切取侵染区域，在 激光共聚焦显微镜（）观察亚细胞定位。图融合表达载体 构建 结果与分析 油菜，木糖基转移酶基因 克隆根据 中已登记的甘蓝型油菜，木糖基转移酶基因 保守区序列，设计 引物和 引物，使用 和 试剂盒分别扩增获得 和 的，木糖基转移酶基因 端片段（图）和 端片段（图）。对，木糖基转移酶基因 端和 端的目的
12、条带分别进行切胶回收、纯化，纯化后的 产物分别西北农业学报 卷与 连接，转化大肠杆菌后挑取阳性克隆测序，测序结果见图和。测序正确后，利用 软件将克隆获得的 基因 端序列和 端序列与保守区序列拼接，拼接后测序表明，油菜 含有 的完整开放阅读框，编码 个氨基酸，该基因命名为 （登记号 ）。油菜，木糖基转移酶基因 生物信息学分析利用测序氨基酸序列，同源比对芸薹属基因 编码的氨基酸序列，发现与甘蓝型油菜（）、白菜（）、芥 菜型油菜（）、甘蓝（）和黑芥（）具有高度的相 似 性，相 似 性 分 别 为 、和 ，与同科的拟南芥 相似性为 。保守域结构比对发现，油菜 具有 家族保守的 保守结构域（表示除脯氨酸
13、以外的任何氨基酸，或者没有）。还存在 糖基转移酶一段由 个 氨 基 酸 组 成 的 （）保守结构域（图）。在 预 测，分 子 质 量 约 ，由 个 原 子 组 成，分 子 式 为 。正电荷残基总数（精氨酸，赖氨酸）为，负电荷残基总数（天冬氨酸，谷氨酸）为 。脂 肪 指 数 为 ，亲 水 性 为 ，蛋白质不稳定指数为 ，因此推测该蛋白属于不稳定亲水蛋白，属于糖基转移酶 家族成员（图）。端扩增片段；端扩增片段；端测序结果；端测序结果 ；图，木糖基转移酶基因 端和 端 扩增 ，利用 和 预测油菜 糖基化和磷酸化位点发现，蛋白中存在个糖基化位点（、和 ）（图），多个磷酸化位点，从多到少依次为丝氨酸，苏
14、氨酸和酪氨酸，也存在糖原合成酶激酶（）、细胞分裂周期激酶（）、蛋白激酶（）、络蛋白激酶（）、蛋白激酶（）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（）等多种特异性蛋白激酶结合位点（图），跨膜域预测表明，具有一个单次跨膜区，为膜蛋白（图），不存在信号肽，属非分泌性蛋白（图）。对 蛋白结构进行预测分析，结果表明该蛋白二级结构中螺旋结构（）占 ，片 层（）占 ，无规则卷曲（）占 ，延伸链占 。蛋白三级结构源建模使用的模板为人类，葡萄糖糖基转移酶，其同源性为 （图）。以白菜基蛋白质数据库作为参考，预测分析 蛋白与其他蛋白的相互作用，发现 与白菜 （拟期董云等：油菜（），木糖基转移酶基因 克隆、序列分析及亚细胞定
15、位南芥 同源基因，催化葡糖醛酸基转移酶）互作分数最高为 ；其次与白菜 （蔗糖裂解酶，为各种代谢提供 葡萄糖和果糖）互作，参与生物催化反应；与 ，和 等互作分数都达到 以上。这些预测的互作蛋白都与各类糖合成和转运有关。同源比对和互作分析初步表明 可能参与木糖的合成代谢过程（图）。红色框区域分别代表跨膜区、高度保守的 盒和 特征结构域 ，图芸苔属植物 氨基酸序列比对 油菜，木糖基转移酶基因 融合表达载体构建根据 基因拼接序列设计的上下游引物 、与 序 列 中 间 设 计 的 引 物 、分别配对，以油菜 为模板 进 行 扩 增。和 产物分别为 和 （图），胶 回 收 扩 增 片 段，分 别 与 载体
16、连接，经菌液 检测后选取阳性克隆，分别使用 和 ，和 进行双酶切鉴定，切下的目的条带分别为 和 （图），送交测序验证。测序验证后用 和 ，和 进行双酶切测序质粒载体，分别回收 和 的 片 段。同 时 用 和 双 酶 切 质粒，胶回收、纯化大片段，与回收的 基因 和 的两段双酶切序列片段进行体外连接，随后转化到大肠杆菌感受态细胞中，用 进行菌液 鉴定，阳性克隆测序验证正确（图）。油菜，木糖基转移酶 亚细胞定位将 构 建 的 融 合 表 达 载 体 和空载体 分别转化农杆菌 ，将活化的农杆菌注射烟草叶片，黑暗条件下保湿培养后利用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的分布情况。由图可见，的荧光信号主要分布在细胞质中，而对照 在细胞核和细胞质中均观察到绿色荧光信号，结果表明，木糖基转移酶 定位于细胞质。西北农业学报 卷图油菜 蛋白保守结构域（），糖基化位点（），磷酸化位点（），蛋白跨膜结构域（）和信号肽（）预测 （），（），（），（）（）图油菜 蛋白三级结构（）和互作蛋白分析（）（）（）讨 论干旱、盐害、极端温度、病虫害等非生物和生物胁迫严重影响油菜生长发育和油菜品质，提高油菜逆境抗性，保持稳产优