1、第 36 卷第 6 期2022 年12 月长治医学院学报JOUNALOFCHANGZHIMEDICAICOLLEGEVol36No6Dec2022基金项目:山西省卫生健康委员会科研项目(2018121;2019138);山西省“1331 工程”协同创新中心提质增效建设项目(20215221);长治医学院科技创新团队项目(CX202001)作者单位:1 长治医学院第一临床学院(046000);2 长治医学院公共卫生与预防医学系作者简介:杨丹丹，女，在读硕士，研究方向:肠道菌群与肿瘤研究;通信作者:郑金平，男，教授，博士研究生导师，研究方向:环境与肿瘤、神经退行性病变研究，E-mail:zheng
2、jp 。幽门螺杆菌感染对健康人群肠道菌群的影响研究杨丹丹1黄兴强1贾琳倩1朱东强1吴紫莹1郑金平2摘要目的:分析幽门螺杆菌(Hp)感染对健康人群肠道菌群的影响，探讨幽门螺杆菌感染对健康人群的潜在危害。方法:选取山西省长治市某医院健康体检人群中 Hp 检测呈阳性和阴性的人各 25 例为研究对象，收集个人基本信息表，留取粪便标本，采用微生物 16SrDNA 扩增子技术测定粪便肠道菌群。结果:Hp 感染阳性组与阴性组肠道菌群的 Alpha 多样性及 Beta 多样性均存在统计学差异(P0.05);在门水平上 Hp 感染阳性组疣微菌门及脱铁杆菌门丰度较阴性组减少，在属水平上 Hp 感染阳性组的粪杆菌较
3、阴性组减少，差异均有统计学意义(P0.05);2 组之间共富集有 14 个显著差异的代谢通路，主要与丁酸盐的生成、糖代谢以及钴啉酸 a，c二酰胺生物合成代谢等途径有关;变形菌及 S24_7 菌群的 OC 曲线下面积分别为 76.9%、74.7%。结论:Hp 感染会改变健康人群肠道菌群的构成及多样性，使肠道菌群发生紊乱，增加某些疾病发生的风险;变形菌及 S24_7 菌属具有区分有无 Hp 感染的生物标志的潜力。关键词幽门螺杆菌;肠道菌群;16SrDNA中图分类号117文献标识码A文章编号10060588(2022)0640608Effect of Helicobacter Pylori Infe
4、ction on Intestinal Flora in Healthy PopulationsYANG Dandan，HUANG Xingqiang，JIA Linqian，ZHU Dongqiang，WU Ziying，ZHENG JinpingThe First Clinical College of Changzhi Medical CollegeAbstractObjective:To analyze the effect of Helicobacter pylori(Hp)infection on intestinal flora and the potential disease
5、risk in healthy individuals Methods:25 cases of Hp positive or negative were selected from a health check-up population in a hospi-tal in Changzhi，Shanxi Province respectively Personal basic information and stool samples were collected，and microbial 16SrDNAamplicon technology was used to determine f
6、ecal flora esults:There are significant differences in Alpha diversity and Beta diversi-ty of intestinal flora between Hp positive and negative groups(P0.05)At the phylum level，the abundance of verrucomicrobiaand deferribacteres was lower in the positive Hp infection group compared to the negative g
7、roup The genus faecalibacterium was low-er in the positive Hp infection group compared to the negative group，and the differences were statistically significant(P0.05)Between the two groups，14 substantially different metabolic pathways were enriched，primarily related to butyrate synthesis，glu-cose me
8、tabolism，and cobalamin a，c-diamide biosynthetic metabolism The areas under the OC of Alphaproteobacteria and S24_7flora are 76.9%and 74.7%respectively Conclusion:Hp infection alters the makeup and diversity of the intestinal flora in healthypeople，which may cause intestinal flora disorder and increa
9、se the risk of some diseases Alphaproteobacteria and S24_7 have thepotential to be a biomarker to distinguish Hp infection positive from negativeKey wordshelicobacter pylori;intestinal flora;16SrDNA幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰氏阴性菌，1994 年被世界卫生组织列为类致癌物12。Hp 通常是在儿童时期获得的，若不进行相关治疗有可能会终生携带。在 Hp 感染的人
10、群中，大多数人表现为无症状感染，有 1%3%的人发展为胃癌3。有研究在动物模型中发现 Hp604第 6 期杨丹丹等幽门螺杆菌感染对健康人群肠道菌群的影响研究感染与肠道菌群之间存在联系45。Hp 感染不仅影响胃微生物群落结构，可能还具有全身效应，可改变远端肠道的微生物区系6。但 Hp 感染是否会通过影响健康人群肠道菌群的变化而增加致病的风险尚不清楚。本文通过对 Hp 感染和未感染的健康体检人群肠道菌群进行 16SrDNA 测序和分析，探讨 Hp 感染对健康人群肠道菌群的影响及意义。1对象与方法1.1研究对象选取 2021 年 8 月至 2022 年 4 月在山西省长治市某医院体检的经13C 或1
11、4C 检测为 Hp 阳性和阴性的健康人为研究对象各 25 例。本研究经长治医学院伦理委员会批准，所有入选者的问卷调查、粪便采集均得到本人的知情同意。纳入标准:(1)年龄18 岁，2 组按照年龄(3 岁)为匹配条件进行配对;(2)无消化道不适症状及其他重大疾病史;(3)3 个月内未服用过任何抗生素;(4)能获得粪便标本及相关个人信息。1.2粪便样本采集采集符合条件的研究对象粪便 50100 mg 中段粪便于灭菌后的容器中，并置于80 冰箱内保存。1.3粪便 DNA 提取及 16SrDNA 测序采用 Nanodrop 对 DNA 定量，通过 1.2%琼脂糖凝胶电泳对 DNA 提取质量进行检测。PC
12、 的扩增采用 Pfu 高保真 DNA 聚合酶(全式金公司，北京)。对 PC 扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为 Quant-iTTMPicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为 Microplate reader(BioTet，FLx800)。根据荧光定量结果及各样本的测序量需求，对每个样本按照相应比例混合。采用 ILLumina TruSeq NanoDNA LT Library Prep Kit(Illumina 公司，加利福尼亚)制备测序文库。高通量测序上机前通过 Agi-lent 之后，通过 Quant-iTTMPicoGreen dsDNA AssayKit 在
13、Promega QuantiFluor 荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应 2 nM 以上。将合格的每个上机测序文库(Index 序列不可重复)进行梯度稀释后，根据相应测序量按一定比例混合，并经 NaOH 变性为单链;在 Illumina MiSeq/NovaSeq平台上对群落 DNA 片段双端(Paired-end)测序。使用 语言脚本，统计所有样本包含的高质量序列的长度分布。应用 QIIME2(2019.4)软件进行物种分类学注释。1.4统计学方法用 Chao1 指数、Observed species 指数、Shannon指数、Simpson 指数、Faith s PD 指数、
14、Pielou s even-ness 指数和Good s coverage 指数进行 Alpha 多样性分析，并绘制成箱线图，通过 Kruskal-Wallis 秩和检验指数验证差异的显著性。通过 Jaccard 距离，Bray-Curtis 距离，Unweighted uniFrac 距离和 PCoA及 Adonis 差异分析进行 Beta 多样性分析;通过LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size)分析寻找标志物种，检验水准=0.05。建立随机森林模型寻找属水平下不同组别的标志物种，并使用OC 曲线进行诊断预测，使用 PICUSt2(Phy
15、loge-netic investigation of communities by reconstruction ofunobserved states)分析预测肠道菌群的潜在功能。2结果2.1一般情况研究对象按照年龄(3 岁)为匹配条件，Hp阳性组平均年龄(57.165.80)岁，Hp 阴性组平均年龄(57.846.08)岁，均为山西省长治市的汉族人群。Hp 感染阳性和阴性组之间性别、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、体质量指数等差异均无统计学意义(P0.05)。见表 1。2.216SrDNA 测序结果对 50 例研究对象的粪便样品进行高通量测序，样本序列有效长度范围为 48 441 bp，平均
16、413 bp。将去噪或去噪后得到的 OTU 代表序列与数据库进行比对和分析，根据物种分类学注释所示(图1A)，Hp 阳性组的 OTU 总数为 25 224，OTU 平均数为 1 009;Hp 阴性组的 OTU 总数为 28 709，OTU 平均数为 1 148。通过分类单元数的统计(图 1B)，Hp阳性组肠道菌群有 7 个门，12 个纲，16 个目，28 个科，41 个属，38 个种;Hp 阴性组有 8 个门，15 个纲，20 个目，35 个科，49 个属，41 个种。2.3肠道菌群的 Alpha 多样性分析2.3.1稀疏曲线随着测序深度的增加，稀疏曲线末端趋于平坦，继续增加测序深度已无法检测到大量尚未发现的新 OTU，表明测序数据合理，测序深度足以覆盖大多数细菌，测序结果可反映当前样本所包含的多样性。见图 2。704长治医学院学报2022 年第 36 卷表 1Hp 阳性组与 Hp 阴性组基本信息表 例(%)因素Hp 阴性组(n=25)Hp 阳性组(n=25)2P性别男13(52)18(72)2.1220.145女12(48)7(28)饮酒是9(36)13(52)1.2990.254否